combiner le Séquençage à haut débIt et la Microfluidique en gouttelette pour l’analyse statistique de la réponse ADaptative des Biomolécules. – SIMBAD

Notre but est d'identifier les paramètres génotypiques qui contrôlent l'évoluabilité des protéines, et donc leur potentiel d'adaptation à des pressions de sélection variables en optimisant leur fonction et/ou en acquérant de nouvelles fonctions par évolution darwinienne. Mesurer l’évoluablité d’une protéine nécessite la mesure de la « fitness » des protéines obtenues par évolution darwinienne à partir de la protéine d’intérêt. Pour cela nous reconstruirons les trajectoires évolutives de millions de protéines (avec pour modèle une enzyme) soumises à des pressions de sélection variables dans des conditions contrôlées au laboratoire. Nos expériences d’évolution dirigée par microfluidique en gouttelettes produiront des cartes génotype-phénotype de millions de mutants d’une enzyme. Les paramètres contrôlant l’adaptabilité des protéines seront extraits par des méthodes statistiques. Notre approche est basée sur une combinaison originale de techniques de microfluidique en gouttelettes et séquençage ADN à haut débit couplées via l’étiquetage par un code-barre ADN permettant de relier génotypes et phénotypes à l’échelle de millions de protéines, en une journée. Notre projet fortement interdisciplinaire implique la biologie évolutive, la microfluidique en gouttes, la chimie organique, le séquençage ADN, et la physique statistique.

Les expériences d’évolution dirigée permettent de contrôler précisément la pression de sélection, le taux de mutation aléatoire, de suivre des échelles de temps aussi longues que l’on veut, et donc de surmonter certaines des limitations de l’étude des processus biologiques adaptatifs. Le développement récent des techniques de séquençage à haut débit permet de suivre en parallèle de larges populations de mutants et donc de développer une analyse statistique de l’adaptation au niveau moléculaire.

Nous proposons d’analyser, à une échelle et une résolution sans précédents, les trajectoires évolutives de bio-molécules soumises à des pressions de sélection contrôlées au laboratoire. Nous combinerons l’évolution dirigée par microfluidique en gouttelette et le séquençage à haut débit pour étudier l’adaptation d’une protéine-modèle, l’enzyme SGAP (Streptomyces griseus aminopeptidase). Nous évoluerons l’enzyme SGAP, qui est naturellement une leucine-aminopeptidase, afin qu’elle acquiert des fonctions nouvelles telles que valine- ou glycine- aminopeptidase, ou phosphodiesterase. Nous effectuerons l’évolution dirigée d’une population de variants de SGAP en sélectionnant pour des niveaux arbitraires d’activité enzymatique associée à ces nouvelles fonctions grâce aux substrats fluorogéniques que nous développons et produisons au laboratoire. L’analyse à haut débit par microfluidique en gouttelette fournira les phénotypes respectifs de 10^6 variants en moins d’une heure et les variants seront triés en fonction de leur phénotype. Après cette étape de tri, les gènes des variants seront étiquetés avec un code-barres portant leur phénotype et la condition de sélection. Le séquençage à haut débit des gènes étiquetés fournira une cartographie de la relation génotype/phénotype de 10^6 variants, en une seule expérience massivement parallèle. L’analyse statistique des données de séquençage permettra de reconstruire les trajectoires évolutives de chacun des 10^6 variants soumis à des pressions de sélection successives, et d’extraire ensuite les paramètres qui déterminent le potentiel adaptatif des bio-molécules.
Notre étude fournira une représentation à grande échelle de la réponse biologique adaptative aux pressions de sélection au niveau moléculaire, et une compréhension plus profonde des mécanismes d’évolution de nouvelles fonctions des protéines et de leur optimisation. Les résultats attendus et notre nouvelle stratégie auront des applications avec un impact très large, notamment pour l’optimisation d’enzymes d’intérêt industriel, de protéines thérapeutiques, et de la conception d’anticorps et vaccins anti-viraux.