Analyse en profondeur de répertoires d'anticorps par microfluidique en gouttelettes couplé à du séquençage haut-débit pour le diagnostic et la découverte d'anticorps thérapeutiques – DROP-mAbs

Nous visons à développer un système de ultra-haut débit pour le criblage et la caractérisation de répertoires de lymphocytes B primaires. Ce système, basé sur la combinaison de la microfluidique en gouttes avec du séquençage de nouvelle génération, permettra un criblage quantitatif de millions de cellules B primaires par jour en fonction de l'affinité des anticorps qu’elles sécrètent , ou une autre activité (le phénotype). Une stratégie de séquençage utilisant des codes-barres d'ADN et une analyse bioinformatique dédiée permettra de conserver l’appariement original des séquences de la chaîne lourde (VH) et la chaîne légère (VL) de l'anticorps produit par chaque cellule B (génotype). La combinaison des deux étape permettra de déterminer la séquence et l'activité de chaque anticorps dans le répertoire immunitaire.

DROPmAbs réunira des expertises transdisciplinaires et un partenaire industriel pour développer des tests et standardiser les processus. Comme 7 des 10 « top » médicaments sont à base d'anticorps, les entreprises pharmaceutiques investissent massivement dans l'amélioration et la rationalisation de la découverte d'anticorps pour compresser les délais, réduire les coûts et améliorer le nombre d'anticorps candidats. Notre projet répond à ces besoins en développant un système ultra-haut débit pour identifier des anticorps pour le diagnostic et la thérapie.

La microfluidique en gouttes utilise des gouttes aqueuses monodispersées de quelques picolitres dans une phase continue d'huile inerte. Ces gouttes forment des microréacteurs bio-compatibles indépendants qui peuvent être générés et manipulés à des fréquences de l’ordre du kHz pour des dosages biologiques à ultra-haut débit. Plus d’un million de cellules B primaires uniques seront compartimentées dans des gouttes avec un bio-essai permettant de mesurer l'affinité de l'anticorps sécrété, et immédiatement triées sur ce critère. Pour le séquençage, les cellules triées seront individuellement re-compartimentées dans des gouttes contenant des réactifs de lyse, de transcription inverse (RT) et des amorces composées d’un code-barres unique et des séquences spécifiques pour les VH et VL. Après la RT, les gouttes seront brisées, et les ADNc obtenus amplifiées par PCR pour le séquençage. L'analyse bioinformatique permettra d’apparier les séquences VH et VL de l’anticorps d’origine - portant chacune le même code-barres - permettant ainsi de relier les séquences (génotype) à l'affinité (phénotype).
Aucun autre système ne possède cette capacité de cartographie génotype-phénotype applicable à des millions d'anticorps. La technologie des hybridomes ne peut pas être utilisée avec les cellules B humaines et n’est efficace que pour une fraction faible (1/10e5) de leur répertoire. Des techniques plus récentes permettent soit du phénotypage à haut-débit en perdant l’appariement VH- VL (phage display), soit le phénotypage de seulement <1000 cellules B uniques, soit le séquençage de grands répertoires d'anticorps mais sans données de phénotype ni appariement VH-VL.

Nous sommes persuadés que cette technologie représente un changement de paradigme dans le criblage des anticorps. Elle permettra une étude approfondie de répertoires d'anticorps avec de multiples applications en recherche fondamentale, pour le diagnostic/pronostic de maladie idiopathiques, le développement de vaccins, et la découverte d'anticorps thérapeutiques.
Nous proposons d’utiliser ce système pour faire les premières cartes « anatomiques » détaillées de la réponse B et de la dissémination de clones B dans des organes lymphoïdes et non-lymphoïdes, en fonction de la nature de l'antigène et de la voie d’immunisation. Nous proposons aussi d’étudier la nature pathogène des anticorps dans une situation pathologique humaine donnée (choc allergique) comme une preuve de concept pour l'établissement de criblages diagnostiques dans des maladies idiopathiques dans lesquelles les anticorps pourraient être des déclencheurs ou des effecteurs.