DS0401 - Une nouvelle représentation du vivant

Mieux comprendre les stades précoces et tardifs de l’assemblage des noyaux Fe-S dans la mitochondrie – FRATISCA

La combinaison d’approches à la fois in vitro et in vivo pour comprendre la fonction des protéines et les mécanismes moléculaires impliqués dans la biogénèse des Fe-S est indispensable pour éclaircir les étapes liées à ce processus central au sein de la cellule. Les méthodes utilisées:
- biochimie, reconstitution des noyaux Fe-S
- approches spectroscopiques- RPE et Mossbauer
- Co-Immunoprecipitation suivi de spectrométrie de masse
- knockdown in vivo en utilisant des AAV
- Crystallographie

Pour étudier ISCA1 et ISCA2 et leur fonction, nous avons d’une part cloner les gènes murins et produit les protéines recombinantes afin d’étudier leur comportement biochimique in vitro, et d’autre part mis en place une étude fonctionnelle in vivo utilisant une approche d’ARN interférence via l’injection de virus adéno-associé (AAV) exprimant un shRNA spécifique dans le muscle squelettique de la souris. Le travail in vitro a montré que les deux protéines pouvaient être purifiées directement de la bactérie avec un cofacteur Fe-S. L’analyse biophysique a identifié des centres Fe2S2 dans les deux cas, mais le centre Fe-S sur ISCA1 s’est révélé plus sensible à l’oxydation que celui sur ISCA2, suggérant des fonctionnalités différentes pour les centres Fe-S des deux protéines. Par injection locale d’un AAV exprimant un shRNA spécifique, nous avons ainsi établi une diminution significative de l’expression d’ISCA1 ou ISCA2 dans le muscle tibialis antérieur de souris adultes afin d’étudier le phénotype primaire induit. Les résultats ont montré que la diminution de l’expression d’ISCA1 affecte l’activité de protéines à centres Fe-S, et plus précisément les protéines contenant des centres Fe4S4. Cependant, la diminution d’ISCA2 n’aboutit à aucun phénotype identifiable dans le muscle en conditions physiologiques normales. De plus, en surexprimant ISCA2 dans un muscle dans lequel l’expression d’ISCA1 est affectée par ARN interférence, le phénotype induit n’est pas modifié, démontrant l’incapacité d’ISCA2 à opérer à la place d’ISCA1. Les deux protéines ne sont donc pas fonctionnellement redondantes. Ces résultats ont été complétés par une approche d’immunoprécipitation couplée à une étude protéomique par spectrométrie de masse afin d’identifier les partenaires protéiques d’ISCA1 et ISCA2. Des partenaires spécifiques à l’une et l’autre des protéines ont été mis en évidence, fournissant des éléments supplémentaires suggérant une fonction différente pour ISCA1 et ISCA2.

Les perspectives sont de continuer à étudier les étapes précoces de la biosynthèse de Fe-S, notamment en se concentrant sur la fonction de la frataxine au sein du complexe CIV. Dans un deuxième temps, nous souhaitons identifier les mécanismes moléculaires impliquées dans le transfert de noyaux Fe-S par les ISCAs.

Aucune

Résumé de soumission

Les protéines à noyau fer-soufre (Fe-S) sont des composantes essentielless de la cellule, impliquées dans de nombreux processus physiologiques, importants pour la synthèse et la stabilité du génome nucléaire, la traduction des protéines, le métabolisme mitochondrial et la respiration cellulaire. Durant cette dernière décennie, la biogenèse des protéines Fe-S a été largement étudié par des approches génétiques et biochimiques chez la bactérie et la levure, et plus récemment chez les plantes et les mammifères. Ceci a permis de démontrer que c’est un processus complexe impliquant beaucoup de protéines, fortement conservées de la bactérie à l'homme. Le processus de maturation des protéines Fe-S est une voie de biosynthèse fondamentale et essentielle. Chez l'homme, des mutations dans plusieurs composants de cette machinerie sont associées à des troubles graves tels que les maladies neurodégénératives, la myopathie et de l'anémie, soulignant l'importance de cette voie pour la fonction cellulaire normale. Chez les eucaryotes, la première étape de la biosynthèse Fe-S se produit dans la mitochondrie, par un complexe multiprotéique, impliquant la formation de façon transitoire d’un noyau Fe-S sur une protéine dite d'échafaudage à partir de soufre inorganique et de fer ferreux. Le soufre est fourni par une activité enzymatique portée par une cystéine désulfurase. La source de fer et d'électrons, nécessaires dans le mécanisme de formation des centres Fe-S, n'ont pas encore été clairement identifiés, bien que les données expérimentales suggèrent que la frataxine et la ferrédoxine soient respectivement impliquées, Nous avons récemment démontré que dans la phase initiale de la biogenèse des centres Fe-S, la frataxine joue un rôle clé en contrôlant l'entrée de fer au sein de la scaffold via l'activation de la cystéine désulfurase, et qu'elle est essentielle pour assembler et protéger le noyau Fe-S dans celle-ci. Ces résultats fournissent des informations solides sur le rôle de la frataxine pour la biosynthèse des noyaux Fe-S, et ouvre de nouvelles voies pour mieux élucider le mécanisme moléculaire de formation des noyaux Fe-S. Une fois pré-assemblé au sein de la scaffold, le noyau Fe-S, exposé et labile, est transféré aux protéines mitochondriales cibles à l'aide de plusieurs protéines et facteurs accessoires. Les protéines impliquées et ce mécanisme de transfert sont encore mal caractérisées et les interactions qui les animent partiellement connues. Nos objectifs au sein de ce projet ANR sont d'obtenir de nouvelles connaissances sur la machinerie d’assemblage Fe-S mitochondriale des mammifères, en particulier sur les premières étapes de l'assemblage du noyau Fe-S impliquant la frataxine et la ferredoxine, et les étapes ultérieures de transfert des noyaux Fe-S aux protéines mitochondriales. Ce projet de recherche fondamentale abordera ces questions par une approche multidisciplinaire, combinant des données structurales avec la biochimie, la biophysique et des études physiologiques et moléculaires chez l'animal. La combinaison d’approches à la fois in vitro et in vivo pour comprendre la fonction des protéines et les mécanismes moléculaires impliqués dans la biogénèse des Fe-S est indispensable pour éclaircir les étapes liées à ce processus central au sein de la cellule.

Coordination du projet

Hélène PUCCIO (INSTITUT DE GENETIQUE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IGBMC INSTITUT DE GENETIQUE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE
CNRS/CEA/UJF/Biocat Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux
IBS Institut de Biologie Structurale /Groupe Métalloprotéines
CEA/DSV:iRTSV/LCBM Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux

Aide de l'ANR 550 000 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2014 - 36 Mois

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