Hérédité épigénétique transgénérationnelle chez les ciliés : mécanismes et conséquences évolutives – INFERNO

Une difficulté technique majeure est la purification de micronoyaux en quantité suffisante pour permettre le séquençage et l’assemblage des génomes, y compris leur fraction répétée. Nous avons mis au point une méthode basée sur la cytométrie en flux de micronoyaux marqués par un colorant fluorescent de l’ADN et par une protéine de fusion (CenH3-GFP) fluorescente absente des macronoyaux. Celle-ci permet d’obtenir suffisamment d’ADN pour obtenir une bonne couverture des génomes par les techniques de séquençage à haut débit, mais pas pour générer les liens clones nécessaires à un assemblage complet des séquences répétées. Pour obtenir ces liens clones, nous utiliserons l’ADN de macronoyaux différenciés après déplétion de l’endonucléase Pgm (dont le génome est amplifié à forte ploïdie mais pas réarrangé), qui peut être obtenu en quantité bien plus importante. Après assemblage par des procédés standard, les IES seront identifiées par comparasion avec les génomes macronucléaires des mêmes souches (séquencés en collaboration avec Michael Lynch, Indiana University). L’annotation des éléments transposables sera réalisée en collaboration avec H. Quesneville à l’aide d’un pipeline dédié et de curation manuelle. L’identification des centromères repose sur l’immunoprécipitation de chromatine avec des anticorps dirigés contre l’histone centromérique CenH3, le séquençage et l’analyse bioinformatique des séquences obtenues. La déplétion de Pgm (et d’autres facteurs potentiellement impliqués dans les réarrangements ou dans la voie des scnARN) utilise une technique simple et efficace d’ARN interférence, qui consiste à nourrir les cellules avec des bactéries produisant de l’ARN double-brin homologue au gène à inactiver. Nous testerons alors notre hypothèse centrale en séquençant le génome macronucléaire d’hybrides F1 inter-souches et inter-espèces, pour évaluer la fréquence des défauts d’excision d’IES polymorphes dans des gènes potentiellement essentiels.

L’ADN de micronoyaux de P . tetraurelia purifiés par le partenaire 2 a été séquencé et est en cours d’assemblage au Génoscope. Ceci constitue la phase pilote du projet France Génomique, qui nous permettra d’ajuster la méthodologie à employer pour les autres souches et espèces. En parallèle, nous avons commencé à séquencer l’ADN micronucléaire d’autres espèces, et à préparer des échantillons d’ADN macronucléaire de 2 souches par espèce, et d’hybrides F1 entre ces souches. Concernant les centromères, un premier essai de ChIPseq CenH3 a été réalisé et analysé; d’autres essais ont été prévus. Les mutants obtenus par nos cribles visant la voie des siRNA ou celle des scnRNA sont en cours d’identification et d’étude, ainsi que le rôle de facteurs candidats. Une étude plus ciblée du croisement entre les souches 32 et 51 de P. tetraurelia a montré que le phénomène de rétention d’une IES chez les hétérozygotes F1 dérivant du parent naïf peut être généralisé à au moins une autre IES, parmi les 7 IES présentes dans une souche mais absente dans l’autre. De la même manière que pour l’IES du gène mtB, la rétention est plus forte du côté naïf mais elle est également détectable de l’autre côté, ce qui ne peut s’expliquer par un défaut de scnRNA maternels. Nous faisons l’hypothèse que la nature hémizygote de ces séquences dans les F1 résulte en un autre problème affectant l’excision, possiblement apparenté au ‘Meiotic Silencing of Unpaired DNA’. Des résultats préliminaires suggèrent qu’il s’agit bien de deux effets distincts: l’inactivation de Ptiwi03, paralogue de fonction inconnue des protéines chargeant les scnARN, semble augmenter la rétention spécifiquement du côté naïf, suggérant qu’elle pourrait être impliquée dans l’échange de scnARN entre conjugants, tandis que celle de Dcl5, protéine putativement impliquée dans un mécanisme d’amplification de l’action des scnARN pendant le développement, augmente cette fréquence des deux côtés.

La validation de notre hypothèse centrale représenterait une avancée majeure: le mécanisme impliqué serait remarquablement similaire à la dysgenèse hybride observée chez la drosophile, et qui résulte de la nécessité de piRNA maternels pour contrôler les tranposons introduits par le gamète paternel. Il pourrait donc s’agir d’un mécanisme général contribuant à la spéciation chez de nombreux eucaryotes. Des résultats préliminaires suggèrent l’existence d’un phénomène distinct, dû à la nature hémizygote des séquences concernées plutôt qu’au défaut de petits ARN maternels, mais qui contribuerait de la même manière à la dysgenèse hybride. L’évidence préliminaire que de nouveaux facteurs semblent contrecarrer ces effets délétères suggèrent l’hypothèse très intéressante que les espèces du groupe P. aurelia se sont adaptées à ces difficultés, en inventant de nouveaux mécanismes, impliquant possiblement de nouvelles voies de petits ARN, qui permettent l’échange d’informations épigénétiques, et non pas seulement du génome mendélien, entre partenaires sexuels.

1. Singh, D.P., Saudemont, S., Guglielmi, G., Arnaiz, O., Goût, J.F., Prajer, M., Potekhin, A., Przybòs, E., Aubusson-Fleury, A., Bhullar, S., Bouhouche, K., Lhuillier-Akakpo, M., Tanty, V., Blugeon, C., Alberti, A., Labadie, K., Aury, J.M., Sperling, L., Duharcourt, S., Meyer, E. (2014) Genome-defence small RNAs exapted for epigenetic mating-type inheritance. Nature 509:447-452. Epub 2014 May 7. Selected by Faculty of 1000.

Cette étude de l’hérédité maternelle des types sexuels chez 3 espèces P. aurelia montre que si le type E est toujours déterminé par l’expression de la protéine transmembranaire mtA, les mécanismes développementaux produisant des clones de type O diffèrent : P. tetraurelia et P. octaurelia excisent le promoteur de mtA comme une IES, tandis que P. septaurelia excise des segments de séquence codante du gène mtB, qui code un facteur de transcription spécifiquement requis pour l’expression de mtA. Ce sont les premiers exemples de co-optation de la voie des scnRNAs et de la machinerie d’excision des IES pour la régulation de gènes cellulaires et l’hérédité épigénétique de polymorphismes phénotypiques essentiels.

2. Marker, S., Carradec, Q. , Tanty, V., Arnaiz, O., and Meyer, E. (2014) A forward genetic screen reveals essential and non-essential RNAi factors in Paramecium tetraurelia. Nucleic Acids Res. 42:7268-7280. Epub 2014 May 23.

3. Marmignon A, Bischerour J, Silve A, Fojcik C, Dubois E, et al. (2014) Ku-Mediated Coupling of DNA Cleavage and Repair during Programmed Genome Rearrangements in the Ciliate Paramecium tetraurelia. PLoS Genet 10(8): e1004552. doi:10.1371/journal.pgen.1004552. eCollection 2014 Aug.

4. Lhuillier-Akakpo M*, Frapporti A*, Denby Wilkes C, Matelot M, Vervoort M, Sperling L, Duharcourt S. (2014). Local effect of Enhancer of Zeste-like reveals cooperation of epigenetic and cis-acting determinants for zygotic genome rearrangements. PLoS Genet. In press. (http://www.plosgenetics.org/doi/pgen.1004665)