Development of Dynamic Nuclear Polarization for solid-state NMR studies of membrane proteins – MembraneDNP

En dépit de l’utilisation répandue de la spectroscopie RMN pour l’étude structurale de biomolécules, la faible sensibilité de cette technique limite encore son utilisation et ses performances dans ce champ d’étude. Bien que la RMN du solide puisse fournir des informations structurales intéressantes sur les protéines membranaires et qu’elle recèle un potentiel important pour l’analyse structurale à haute résolution de ces protéines, les problèmes liés à sa faible sensibilité sont particulièrement aigus en phase solide dans laquelle la dispersion et les signaux sont larges et les études concernent souvent des noyaux beaucoup moins sensibles que les protons.
Dans ce contexte, de nouveaux développements instrumentaux ont rendu très récemment accessible un équipement permettant de coupler la RMN du solide à haut champ avec la Polarisation Dynamique Nucléaire (PDN). En permettant un transfert de la polarisation électronique d’un électron célibataire (660 fois plus grande que celle des protons) vers les protons environnants et de là vers des hétéro-noyaux, la PDN peut augmenter de deux ordres de grandeurs les signaux de noyaux de protéines. Cependant, avant que cette approche soit optimisée et devienne largement accessible, plusieurs questions : le développement d’agents de polarisation appropriés, la préparation des échantillons à étudier, la température, les séquences de pulse …, doivent être approfondies. En particulier, en ce qui concerne les protéines membranaires dans des bicouches lipidiques aucun exemple PDN/RMN n’a été décrit et plusieurs questions spécifiques additionnelles ayant trait par exemple à la solubilité des radicaux polarisants ainsi qu’à l’influence des basses températures et des radicaux sur les propriétés de la phase lipidique ou encore des interactions protéine-lipide.
A travers ce projet nous nous proposons d’apporter des réponses à ces questions en suspens. Pour ce faire nous effectuerons une étude systématique des interactions d’une série de radicaux de type nitroxyde, en particulier des dinitroxydes, avec des membranes et nous les utiliserons dans le couplage RMN/PDN. A côté des radicaux déjà utilisés (TEMPO, TOTAPOL, bTbK) nous définirons et mettrons au point la synthèse de divers mono et dinitroxydes particulièrement adaptés au milieu membranaire. Une attention particulière sera portée à l’étude par RMN du solide de membranes orientées, une méthode qui a permis la détermination à haute-résolution de la structure des polypeptides membranaires. Dans ce projet nous décrivons des résultats préliminaires qui démontrent la validité de notre concept concernant la possibilité de bénéficier de la PDN dans ce type d’étude RMN. Nous nous proposons de développer la méthodologie et les agents polarisants nécessaires pour rendre l’approche performante et largement accessible.
L’augmentation de sensibilité attendue devrait rendre possible l’étude par RMN du solide de plusieurs protéines membranaires pro- ou anti-apoptodique de la famille Bcl-2 qui ne peuvent être obtenues qu’en très faibles quantités. Elle devrait aussi permettre la réalisation de diverses expériences de RMN multidimensionnelle, qui demeurent impossibles avec beaucoup d’échantillons de protéines membranaires en raison de la faiblesse des signaux observés.
La mise au point de protocoles, de nouveaux agents de polarisation et les divers développements que nous proposons de réaliser, combinés aux récentes avancées technologiques dans le domaine, doivent permettre d’ouvrir des possibilités jusqu’à ce jour fermées, dans le champ de la RMN du solide. Par la réalisation de ce projet, nous élargirons à la classe importante des peptides et protéines membranaires, le champ de la DNP couplée à la RMN du solide.