Signaux et cellules de la réponse inflammatoire: suivi en temps réel chez un vertébré entier, le danio zébré – ZebraFlam

Le danio zébré (Danio rerio, ou zebrafish), un modèle animal classique de la biologie du développement, est également très bien adapté à l'étude des interactions hôte-pathogène. Sa larve est petite, transparente et supporte très bien une anesthésie prolongée, ce qui la rend très bien adaptée aux méthodes d'imagerie in vivo non invasives. Elle est également aisée à manipuler génétiquement, et dispose d'une immunité innée robuste mettant en jeu des types cellulaires et des cytokines similaires à ceux des mammifères. Il représente donc un outil de choix pour l'analyse de la dynamique spatio-temporelle des réponses inflammatoires.
Nous avons déjà développé des systèmes de visualisation par fluorescence des infections virales chez le danio in vivo et, par ailleurs, nous avons crée une lignée de danios transgéniques nous permettant de suivre la production du principal interféron responsable de la réponse antivirale innée. La combinaison de ces deux outils a permis de montrer qu'il était possible de suivre en temps réel la propagation d'une infection virale dans un organisme vertébré entier, et d'observer simultanément le développement de la réponse de l'hôte, à une résolution où les cellules individuelles sont identifiables.
L'objectif de notre projet est d'étendre cette approche à une analyse fine de la réponse inflammatoire induite au cours de diverses situations infectieuses.
En plus des virus, nous intègrerons à notre analyse le pathogène naturel du danio Mycobacterium marinum, une bactérie très apparentée à M. tuberculosis et qui induit chez le danio une maladie aux caractéristiques physiopathologiques très proches de celles de la tuberculose humaine. Des mutants de M. marinum présentant des défauts de production de certains composants de la paroi cellulaire ou de facteurs impliqués dans la survie intracellulaire seront générés par génétique inverse. Le rôle potentiel de ces molécules dans la modulation de la réponse inflammatoire pourra ainsi être établi. Les différents composants de la réponse de l'hôte - attraction des leucocytes, phagocytose, formation de granulomes, production de cytokines - seront suivis par microscopie en temps réel.
Par ailleurs, nous analyserons les conséquences de la voie d'entrée des bactéries sur la réponse de l'hôte -en parallèle avec l'étude de bactéries entrant par voie naturelle- ainsi que la réponse inflammatoire causée par des biofilms et lors d'une vaccination génique.
Ces études feront appel à la génération de nouvelles lignées de danio transgéniques, basées sur des rapporteurs fluorescents. En plus des productrices d'IFN, ces lignées nous permettront de suivre en temps réel les cellules productrices de TNFa et d'IL10; ainsi que les cellules répondant à ces trois cytokines inflammatoires. Les cellules sources d'IL8 seront également identifiées de cette manière.
Nous développerons également les outils nous permettant de manipuler la réponse inflammatoire, par des approches de gain ou de perte de la réponse aux cytokines, ainsi que par l'ablation spécifique des principales sous-populations de leucocytes innés.
Afin de compléter nos études microscopiques, nous réaliserons une analyse globale des variations du transcriptome induites lors de la phase précoce d'une infection virale ou par M. marinum, et déterminerons la part jouée par la réponse aux IFNs, au TNfa et à l'IL-10. Un modèle du réseau des gènes impliqués dans la réponse inflammatoire du danio sera déduit de cette analyse.
De par son approche intégrée, ce projet aboutira à une dissection des réponses inflammatoires à un niveau de résolution encore inégalé, et probablement à la description de phénomènes encore insoupçonnés. Ces résultats seront largement applicables à la compréhension de l'inflammation chez l'homme, et auront des applications potentielles pour le criblage de drogues anti-inflammatoires ou la formulation rationnelle des adjuvants.