Orthèses moléculaires favorisant la cristallisation de protéines membranaires. Application à la détermination structurale de pompes d’efflux multi-drogues – X-Or

Les protéines membranaires ont des fonctions essentielles, très diversifiées, et constituent donc des cibles de tout premier ordre pour la recherche thérapeutique. Toutefois, les protéines membranaires restent problématiques pour des études structurales car elles sont insolubles dans l’eau. En dépit d'une multitude d'informations concernant la manipulation des protéines membranaires, leur détermination structurale reste une tâche très difficile et elles sont encore très largement sous-représentées dans la Protein Database. Il a été proposé que la cristallisation des protéines membranaires pourrait être considérablement facilitée par l'utilisation d’anticorps spécifiques. En effet, les interactions avec l'anticorps permettent de stabiliser la protéine et de réduire son hétérogénéité conformationnelle. En outre, le fragment d'anticorps augmente la partie polaire de la protéine et favorise donc les contacts cristallins. Toutefois, les anticorps ont des inconvénients importants en biologie structurale puisque la plupart des anticorps, ou des fragments d'anticorps, sont très mal exprimés dans les systèmes de surexpression hétérologues.
Nous proposons de travailler au développement d’une technologie innovante, récemment mise en place: la conception et la production d’orthèses moléculaires synthétiques (nommées alpha-reps). Ces molécules seront sélectionnées après interaction in vitro avec les protéines membranaires cibles. La stabilisation et l'immobilisation de ces dernières est une condition sine qua non à la sélection d’alpha-reps véritablement spécifiques des protéines dans leur état natif. Nous comptons utiliser des polymères amphiphiles (amphipols), pour stabiliser et immobiliser les protéines cibles sur support solide.

Nous avons décidé d’appliquer cette nouvelle stratégie à la problématique de la résistance bactérienne. Parmi les divers mécanismes mis au point par la bactérie pour contrer l'effet des antibiotiques, ces dernières expriment des pompes d’efflux actif. Chez les bactéries Gram négatives, protégées par une membrane externe, les pompes d'efflux sont organisées comme des systèmes à composants multiples, dans lesquels la pompe d'efflux située dans la membrane interne est associée à une protéine périplasmique et une protéine de la membrane externe. Il a été démontré que l'inhibition de ces pompes augmente la sensibilité aux antibiotiques et réduit la probabilité d'émergence de mutants résistants aux antibiotiques. Toutefois, de nombreuses questions demeurent sur le mécanisme réel de transport de la pompe. L'objectif de ce projet est d'explorer des développements méthodologiques visant à donner une impulsion significative dans la compréhension structurale de l'architecture des pompes à efflux.