Mécanisme de la terminaison transcriptionelle par le facteur Rho – TERMINATOR

Bien que Rho ait été découvert au début des années 70, son mécanisme d’action reste mal connu. Nous utilisons ici un ensemble de technologies de pointe afin d’élucider ces mécanismes : la nanomanipulation d’acides nucléiques par pinces optiques ou magnétiques, et la chimie combinatoire permettant de déterminer à haut débit les groupements chimiques impliqués dans les réactions.

- Observation pour la première fois l’activité de translocation de Rho sur molécules uniques. Démonstration du déplacement de l’hélicase sur l’ARN selon un mécanisme de « looping »
- Mise au point d’une nouvelle méthode de mesure de déplacement de billes magnétiques (publication en cours de rédaction)
- Production et purification d’ARN polymérase, avec acides aminés non naturels incorporés en position spécifique
- Mise en place de la technique trNAIP. Application à l’étude de Rho/

Poursuite du projet

1. Schwartz A., Rabhi M.,Margeat E. ,Boudvillain M Analysis of Helicase-RNA interactions using Nucleotide Analog Interference Mapping (NAIM), Methods in Enzymology (2012) 511, 149-169
2. Salas D, Gocheva V, Nöllmann M. Constructing a magnetic tweezers to monitor RNA translocaiton at the single-molecule level. Methods in Molecular Biology (2014).
3. Soares, E., Schwartz, A., Nollmann, M., Margeat, E. & Boudvillain, M. The RNA-mediated , asymmetric ring regulatory mechanism of the transcription termination Rho helicase decrypted by time-resolved Nucleotide Analog Interference Probing ( trNAIP ). Nucleic Acids Res. 42, 9270–84 (2014)
4. Rabhi, M., Gocheva, V, Jacquinot, F, Lee, A, Margeat, E. & Boudvillain, M. Mutagenesis-Based Evidence for an Asymmetric Configuration of the Ring-Shaped Transcription Termination Factor Rho. J. Mol. Biol. 405, 497–518 (2011)

La transcription, le processus de biosynthèse de l’ARN, est la première étape importante de l’expression génique (1, 2). Cette activité enzymatique est assurée par l’ARN polymérase (ARNP) et est contrôlée par de multiples événements dynamiques mal compris qui impliquent les composants du complexe ternaire de transcription (ARNP, ADN et transcrit ARN) et des cofacteurs protéiques ou métaboliques. Les ARNP bactériennes présentent de grandes homologies de séquence, structure et fonction avec les ARNP eucaryotes (2) et constituent donc d’excellents modèles pour l’analyse des mécanismes transcriptionnels. Des facteurs, tels que le facteur de terminaison Rho d’E. Coli, influencent aussi bien l’activité des ARNP bactériennes que celles d’organismes supérieurs (3). Rho est une protéine homo-hexamèrique, qui se lie au transcrit, a une activité ATPase ARN-dépendante, et peut dérouler directionnellement des hélices ARN-ARN et ARN-ADN. Ces propriétés font de Rho un exemple unique de moteur moléculaire ARN-dépendant et structuré en anneau (4, 5). Cependant, les mécanismes par lesquels Rho exerce ses fonctions biologiques restent mal compris. Le grand intérêt suscité par ces mécanismes s’est pourtant récemment renforcé, suite à la démonstration de l’activité régulatrice globale du génome d’E. Coli par Rho (6, 7).
Dans ce projet, nous proposons d’étudier le mécanisme de terminaison transcriptionelle induite par Rho en utilisant une approche innovante qui intègre des expériences de biophysique de molécules uniques et d’analyse chimiogénétique combinatoire. Des mesures en nanomanipulation (pinces optiques et magnétiques) nous permettront de mesurer les caractéristiques physiques élémentaires du moteur Rho (vitesse et taille du pas élémentaire de translocation, coordination inter sous-unités, couplage entre hydrolyse de l’ATP et mouvement, …). Nous utiliserons ensuite une nouvelle forme, résolue en temps, d’analyse chimiogénétique avec des sondes nucléotidiques (trNAIM) pour déterminer la signature cinétique des signaux d’interférence que nous avons découvert récemment (8), et qui révèlent un étonnante périodicité (7nt) d’activation de Rho par des groupements 2’-OH de sa piste ARN. Avec cette nouvelle approche, nous étudierons les mécanismes de communication allostérique dans l’anneau Rho, déterminerons la nature et le réarrangement des interactions Rho-ARN, et expliquerons comment ces éléments gouvernent l’activité de Rho. Nous étudierons également le mécanisme par lequel Rho provoque la dissociation de l’ARNP (et donc la terminaison transcriptionnelle), par des mesures de FRET sur des complexes de transcription uniques et immobilisés. Enfin, nous étudierons Rho dans des environnements plus complexes, notamment en présence des facteurs NusG, Yaeo ou Psu, ou directement dans la bactérie en mesurant l’interaction de Rho avec ses partenaires par des techniques de fluctuation de fluorescence.
Toutes ces informations nous permettront de tester les modèles les plus récents de coordination mécanochimique au sein de Rho, de réviser les modèles de terminaison Rho-dépendante, et de comprendre comment Rho fonctionne dans des contextes régulateurs plus complexes. Plus généralement, ces études permettront une meilleure compréhension des mécanismes utilisés par des hélicases et moteurs analogues (anneaux de type RecA ou AAA+) impliqués dans la ségrégation des chromosomes, la compaction de l’ADN, la conjugaison bactérienne, ou la protéolyse.

1. G. Orphanides et al. Cell 108, 439 (2002).
2. R. H. Ebright, J Mol Biol 304, 687 (2000).
3. T. J. Santangelo et al., J Mol Biol 355, 196 (2006).
4. S. S. Patel, et al. Annu Rev Biophys Biomol Struct 69, 651 (2000).
5. J. P. Richardson, Biochim Biophys Acta 1577, 251 (2002).
6. C. J. Cardinale et al., Science 320, 935 (2008).
7. R. A. Mooney et al., Mol Cell 33, 97 (2009).
8. A. Schwartz et al., Nat Struct Mol Biol 16, 1309 (2009).