Dynamique structurale et fonctionnelle des évènements co-traductionnels survenant au voisinage des ribosomes – RIBO-Dyn

Dans le cadre d’une approche multidisciplinaire, plusieurs niveaux interconnectés d'analyse seront réalisés en utilisant des techniques variées et complémentaires, allant de la biologie moléculaire à la caractérisation structurale en passant par des techniques de biochimie/biophysique.

Plusieurs expériences de purification du ribosome bactérien s ont été mises en place permettant d’obtenir des très bonnes préparations en termes d’homogénéité et propreté. Les ribosomes purs ont été envoyés aux différents partenaires pour les analyses biophysiques respectives. Les purifications des différents RPBs ont été réalisées et mises à disposition des autres partenaires. D’autres purifications avec des étiquettes spécifiques (Strep-tag, his-tag, Cy3) ont étés également réalisées et mises à disposition, d’autres marquages spécifiques sont en cours dans le laboratoire 1. Une interaction entre la METAP bacterienne et la Vp16PDF avec le ribosome a été mis en évidence. L’équipe 2 s’est intéressée à la caractérisation des RBPs par MS. Il a ainsi été montré qu’individuellement les protéines PDF et METAP sont monomériques alors que TF est présente sous deux formes (monomère et dimère). Des expériences visant à caractériser les interactions entre ces RBPs en conditions natives et en l’absence de ribosomes ont été réalisées. Nous avons ensuite travaillé sur l’optimisation des paramètres instrumentaux pour la détection des sous-unités 30S, 50S et 70S du ribosome. Un test fluorescent in vitro a été mis au point par l’équipe 3 afin d’étudier l’interaction entre la PDF et le ribosome.

Avec le projet RIBO-Dyn, nous voulons comprendre la dynamique de ces évènements co-traductionnels. Pour ce faire, nous avons mis en place une approche interdisciplinaire combinant des études in vivo, des études biophysiques ainsi que des approches biochimiques classiques. Ce projet profitera de récent collaborations nationales et internationales avec des groupes ayant des expertises mondialement reconnues et complémentaires (P. Bron, CBS, Montpellier/France, J.D. Puglisi, Stanford University, USA, A. Thompson & P. Legrand, Synchrotron Soleil, Gif-sur-Yvette/ France, W. Wintermeyer, Max Plack Institut, Gottingen/Allemagne). Grâce à ce projet, nous souhaitons obtenir des résultats solides pour proposer un modèle du fonctionnement complexe du ribosome en cours de traduction. A terme, nous disposerons des détails concernant l’existence ou non d’un dialogue dynamique et régulé entre les différents évènements co-traductionnels (maturation et repliement) et la lecture de l’ARN messager, dialogue dédié au bon déroulement de la synthèse protéique.

3 publications en préparation (2 par l’équipe 1 et 1 par l’équipe 4)
2 présentations orales internationales invitées
1 présentation orale nationale invitée
9 présentations par affiche

Le prix Nobel de chimie vient d’être décerné en octobre 2009 aux Pr V. Ramakrishnan, T. Steitz et A. Yonath pour leurs travaux sur la structure du ribosome, une machine moléculaire intracellulaire qui utilise le code génétique pour synthétiser les protéines, ces molécules qui assurent le fonctionnement, le renouvellement cellulaire et la pérennité des organismes. La réalisation d’une carte structurale détaillée du ribosome par ces chercheurs a grandement facilité, dans la dernière décennie, le développement de nouvelles expériences génétiques et biochimiques très sophistiquées. Avec l’essor de méthodes dédiées, un grand pas vers la compréhension des mécanismes de la synthèse des protéines a été réalisé, principalement chez les bactéries. Dans ce contexte, grâce aux modèles montrant comment différents antibiotiques se lient au ribosome, cet énorme complexe est redevenu l’une des cibles majeures pour le développement de nouveaux antibiotiques, une grande partie de l’arsenal classique ciblant déjà ce complexe. Dans le futur proche, il faut s’attendre à d’autres avancées majeures concernant les aspects clés de la traduction. Ces connaissances pourront aider à mieux comprendre les nombreuses pathologies liées aux dysfonctionnements des protéines associées stablement ou transitoirement avec les ribosomes. Dans ce contexte, l’une des grandes questions actuelles est de comprendre les mécanismes co-traductionnels qui surviennent au voisinage du ribosome. En effet, l’étape d’émergence de la protéine en cours de synthèse du tunnel de sortie du ribosome semble particulièrement critique. A cet instant, la cellule effectue alors des choix importants concernant le destin de cette protéine. Ainsi, un certain nombre de facteur RPBs (Ribosome-associated Protein Biogenesis factors) interagissent avec la nouvelle chaîne polypeptidique au niveau du tunnel de sortie du ribosome pour prendre en charge le repliement 3D, effectuer des modifications cotraductionelles et/ou induire des translocations dans les différents compartiments cellulaires. Parmi les protéines RPB, on retrouve différents chaperons comme le Trigger Factor (TF) et les protéines PDF (Peptide DéFormylase) et MAP (Méthionine AminoPeptidase). L'action des RPB commence dès lors que les premiers acides aminés N-terminaux de la protéine surgissent à l’extrémité du tunnel de sortie du ribosome. Compte-tenu de la complexité des évènements à réaliser et de leur hiérarchisation indispensable, l’intervention de ces facteurs co-traductionnels nécessite l’existence de règles spatiotemporelles strictes pour assurer la régulation fine de la dynamique des évènements co-traductionnels au niveau des ribosomes. Une telle régulation est primordiale pour assurer la synthèse de protéines natives et actives.
Depuis quelques années, l’étude de ces interactions parfois très transitoires fait l’objet de nombreuses recherches, et quelques modèles commencent à apparaître. Bien que fascinants, ces modèles posent pour le moment plus de questions qu’ils n’apportent de réponses solides. Dans ce contexte, nous avons récemment démarré au laboratoire un projet visant à mieux comprendre la dynamique des évènements co-traductionnels survenant au voisinage des ribosomes. Le projet que nous proposons ici permettra de répondre à une partie des questions posées. Il s’agit d’explorer les mécanismes de couplage entre les processus de synthèse des protéines et de maturation des chaînes polypeptidiques naissantes, en caractérisant les complexes protéiques présents au niveau du ribosome. Une originalité du projet sera de réaliser en parallèle une analyse sur deux systèmes biologiques complémentaires d'eucaryote supérieur, le système végétal et le système animal, tout en s’appuyant sur le modèle le plus robuste actuellement, le modèle bactérien. Notre étude consistera en une analyse multidisciplinaire du processus utilisant des approches de biologie moléculaire/génétique, de biochimie/biophysique, et de biologie structurale.