Remaniements conformationnels des ribozymes de groupe II – GRP2CONF

Les introns dits ‘de groupe II’ des génomes bactériens et d’organelles constituent des rétrotransposons, dont l’excision sous forme de structure branchée (‘lariat’) à partir d’un ARN précurseur et l’insertion dans des cibles ADN sont catalysées l’une et l’autre par un grand ribozyme, inclus dans l’intron. La catalyse aussi bien de l’étape de branchement que de la ligation des exons par un centre catalytique unique requiert une translocation de la pièce d’ARN qui porte le point de branchement – il s’agit du ‘domaine VI’, le dernier des six domaines de structure secondaire du ribozyme. Malheureusement, alors pourtant que la structure cristallographique d’un ribozyme de groupe II a été récemment publiée, l’image résultante de la molécule reste exclusivement statique et le domaine VI en est complètement absent.
Le but premier de notre projet est de générer, par cristallographie, des structures à résolution atomique de la totalité d’un ribozyme de groupe II – domaine VI inclus – aussi bien dans la configuration permettant la réaction de branchement (première étape de l’épissage), que dans celle qui conduit à la ligation des exons (deuxième étape). Nous espérons ainsi non seulement comprendre les mécanismes moléculaires qui assurent la translocation du domaine VI, mais visualiser des réarrangements du centre catalytique du ribozyme entre les deux étapes de l’épissage : l’existence de tels réarrangements est généralement admise, mais leur étendue exacte reste sujette à discussion. En cas de succès, nos résultats devraient aussi constituer une référence pour les travaux à venir sur les mécanismes catalytiques développés par le complexe d’épissage nucléaire des eucaryotes (spliceosome) : la réaction de branchement et un épissage en deux temps sont communs aux deux systèmes – introns de groupe II et spliceosome – qui paraissent de fait avoir une origine commune.
Même si une partie au moins du récepteur ARN du domaine VI dans sa configuration ‘deuxième étape’ avait déjà été identifiée, son site de fixation en première étape restait complètement inconnu, en dépit d’affirmations contraires. Un point clé de notre stratégie expérimentale est notre aptitude (nouvellement découverte, et encore inédite) à bloquer le domaine VI en configuration ‘première étape’ : c’est ainsi que nous espérons pouvoir cristalliser l’ensemble du ribozyme. Nous projetons aussi de construire des cartes de réactivité/accessibilité des différents états du ribozyme en utilisant des réactifs spécifiques des différents groupements chimiques des bases et du ribose. Ces données devraient complémenter les structures cristallographiques ou, en cas d’échec de la cristallographie, pourraient servir de base à une modélisation à résolution atomique du domaine VI et de ses récepteurs ARN aux différents stades de l’épissage.