Infection par des virus bactériens: analyse moléculaire et cellulaire par microscopie électronique et optique – Vir-imaging

Mon projet concerne des questions de recherche fondamentale et sera effectué en collaboration avec l’équipe de L. Letellier, à l’IBBMC (UMR CNRS 8619) situé à l’Université de Paris-Sud 11 (Orsay). Mon objectif est d’utiliser des approches et techniques originales basées sur mes compétences en physique et en biologie afin d’analyser à l’échelle moléculaire et cellulaire les premières étapes du processus de l’infection virale d’une bactérie. Le transport in vivo du génome (ADN) des phages caudés est un processus complexe, resté pendant longtemps inexploré et en grande mesure incompris par l’absence d’outils d’analyse adaptés. La fixation du phage sur un récepteur spécifique de la surface de l’hôte est suivie de l’éjection de l’ADN du phage et de son transport à travers l’enveloppe bactérienne. Des données récentes de microscopie de fluorescence ont souligné l’importance de considérer l’architecture de l’hôte dans le transport de l’ADN viral. La fixation de différents phages et l’injection de leur ADN semblent plus favorables aux pôles et au septum de la bactérie. Les causes de cette localisation préférentielle restent à déterminer et la question d’une influence directe ou indirecte de l’organisation de l’enveloppe et du cytosquelette bactériens n’a pas été traitée. Mon projet tentera de répondre à ces questions fondamentales par une analyse à l’échelle cellulaire basée sur des techniques d’imagerie parmi lesquelles la cryo-microscopie électronique, la tomographie, le traitement d’images et la microscopie de fluorescence. Dans ce projet, je me propose de m’intéresser au coliphage T5 de la famille des Syphoviridae. Les étapes de fixation sur son récepteur (la protéine de la membrane externe FhuA) et d’éjection de son ADN ont été caractérisées fonctionnellement in vitro. Une caractéristique unique de T5 est le transfert de son génome dans le cytoplasme bactérien en deux étapes. 8% de l’ADN sont d’abord transférés.Ce premier fragment code pour deux protéines, A1 et A2, essentielles au transfert de l’ADN restant. Le mécanisme moléculaire par lequel les protéines A1 et A2 régulent le transfert en deux étapes reste à l’heure actuelle inconnu. Il a été proposé que ces deux protéines puissent agir comme des facteurs de transcription en modifiant la RNAp de l’hôte (la seule utilisée par T5) ou en interagissant avec les promoteurs du phage. Le complexe formé, indispensable au transport de l’ADN, pourrait également jouer le rôle de moteur moléculaire en exerçant une force de traction sur l’ADN du phage. Je tenterai de décrire au niveau moléculaire les réorganisations / changements conformationnels liés à la fixation in vitro du phage sur son récepteur FhuA et au passage de l’ADN à travers la queue. La fixation du phage sur FhuA, l’éjection de son ADN et le transport à travers l’enveloppe de l’hôte seront également étudiés in vivo afin de déterminer si ces processus dépendent de la localisation du récepteur FhuA sur la membrane externe de la bactérie et de l’organisation du cytosquelette bactérien.Par ailleurs, la régulation du transport de l’ADN par les protéines A1, A2 et la RNAp de l’hôte sera analysée afin de déterminer si la RNAp contribue à piloter le transfert de l’ADN de T5 et révéler une interaction potentielle avec les constituants du cytosquelette, en particulier avec MreB. Les différents acteurs impliqués dans le transfert de l’ADN seront caractérisés in vitro et in vivo, par des méthodes de cryo-microscopie électronique et d’analyse en particule isolée, de tomographie et de reconstruction 3D et d’autres techniques physiques parmi lesquelles le SAXS (small angle X-ray scattering). La microscopie corrélative permettra de relier les données ultrastructurales aux informations dynamiques issues de la microscopie de fluorescence sur cellules vivantes. L’ensemble de ces résultats devraient permettre d’obtenir pour la première fois des informations en temps réel, multi-échelles et multi-dimensionnelles.