– SELENOPROTEOME

Le sélénium est un oligo-élément essentiel, originellement connu pour sa toxicité, qui se retrouve maintenant comme supplément vitaminique antioxydant (malgré son étroite fenêtre thérapeutique). De nombreuses études clinques et précliniques suggèrent un effet bénéfique du sélénium lié à la cardiomyopathie, la fonction thyroïdienne, le cancer et le vieillissement (qui sont tous des enjeux majeurs de santé publique). Le mécanisme d?action du sélénium reste élusif dans la plupart des cas, même si l?implication des sélénoprotéines (protéines contenant la sélénocystéine, connue comme le 21ème acide aminé du code génétique incorporé co-traductionnellement) est au c?ur du débat. Vingt-cinq sélénoprotéines humaines ont été identifiées sur la base d?analyses bioinformatique de séquences génomiques. Un tiers de ces sélénoprotéines n?ont jamais été détectées in vivo, et leur fonction reste inconnues. La compréhension à l?échelle moléculaire de la fonction et de la régulation des sélénoprotéines est résolument dépendante de l?existence de méthodologies analytiques adéquates capables de d?étudier l?ensemble du sélénoprotéome in vivo de manière quantitative et simultanée. A présent, la seule technique de détection est basée sur le marquage radioactif utilisant l?isotope 75Se (émission gamma) suivi d?analyse autoradiographique de gel d?électrophorèse. Cette technique est inappropriée pour les études chez l?homme et s?avère difficile à mettre en ?uvre. Les protocoles classiques de protéomique échouent du fait du faible ratio sélénoprotéines/protéines (<10-5) et du manque de spécificité vis-à-vis du criblage de la fraction sélénoprotéome sur l?ensemble du protéome. Ainsi, l?analyse in vivo et simultanée de toutes les sélénoprotéines (ou sélénoprotéome) en terme de détection, d?identification et de quantification nécessite le développement d?une nouvelle méthodologie de détection, basée sur des approches différentes, et constitue le principal objectif de ce projet. L?originalité de notre approche consiste à utiliser le signal spécifique du sélénium des sélénoprotéines obtenu par ICP MS (inductively coupled plasma sector-field mass spectrometry) caractérisée par a une sensibilité absolu de 10-15 g de sélénium (cad 10 attomoles de sélénoprotéines) indépendant de la matrice, et d?une gamme dynamique de 106. La spécificité de chaque sélénoprotéine sera assurée par la mise en place en amont de techniques classique de séparations protéomiques, comme les gels bidimensionnels ou des chromatographies capillaires multidimensionnelles utilisant des interfaces (femtosecond laser ablation ou nanoflow nebulization) précédemment développées et brevetées par le laboratoire du coordinateur du projet (Partenaire 1) dans le cadre des derniers projets ACI et ANR. Par ailleurs, des techniques basées sur l?utilisation d?isotopes stables non radioactifs du sélénium, vont être développées en prenant avantage de la résolution isotopique offerte par l?ICP MS et la précision de la mesure des ratios isotopiques offerte par l?ICP MS en mode multi collecteur. Les développements technologiques et matériels seront effectués sur des sélénoprotéomes de cellules humaines en culture qui sont bien caractérisées. Les changements des conditions de cultures et de déplétion/supplémentation en sélénium vont permettre la validation notre approche pour l?étude de la régulation de la synthèse des sélénoprotéines dans des cellules mammifères dans le laboratoire du Partenaire 2, récemment reconnu pour sa compétence dans la synthèse et la régulation des sélénoprotéines mammifères par une aide jeune chercheur (ATIP CNRS). L?objectif précis est d?étudier la hiérarchie et la cinétique d?expression de toutes les sélénoprotéines de manière simultanée et individuelle. Ce projet novateur est basé sur l?interdisciplinarité des compétences de pointe de chaque partenaire en chimie analytique et en biochimie du sélénium. Le projet cherche à détecter pour la première fois in vivo le sélénoprotéome humain dans sa totalité de manière simultanée et quantitative, constituant les conditions sine qua non pour l?indentification de biomarqueurs de maladies liées au sélénium.