– HAPIHUB

La boite CCAAT est un élément cis trouvé dans environ 30% de promoteurs eucaryote et reconnu par le complexe appelé Heme activator protein (HAP) chez la levure et les plantes et nuclear factor-Y (NF-Y) chez les animaux. Le complexe HAP qui a été abondement étudié chez les mammifères, se compose de trois sous unités : HAP2 ou NFY-A, HAP3 ou NF-YB et HAP5 ou NF-YC. Dans ces systèmes le complexe HAP est requis pour l?activation d?un grand nombre de gènes régulés au cours du développement et notamment pendant le cycle cellulaire et a été montré comme indispensable pour la prolifération cellulaire et le développement embryonnaire chez la souris. De plus ce complexe possède la capacité de se lier à d?autres facteurs de transcription pour contrôler l?expression de gènes. Chez les plantes malgré de récentes découvertes, les connaissances sur la structure et la fonction de complexes HAP sont bien moins avancées. Comme leurs homologues chez les animaux, les gènes codant pour des protéines HAP chez les plantes se classent en trois grandes familles à savoir les HAP2, HAP3 et HAP5. Mais contrairement aux animaux chez lesquels les HAP ne sont codés que par un seul gène, les HAP végétaux sont codés par de petites familles multigéniques d?environ 10 gènes. Avec un tel nombre de sous unités, les plantes ont la possibilité de former une large combinatoire de trimères susceptibles d?avoir été recrutés par des processus très divers et potentiellement spécifique des plantes. En effet des gènes HAP ont été impliqués dans des processus aussi divers que le développement embryonnaire, la résistance à la sécheresse, la signalisation ABA ou la biogénèse des chloroplastes. Notre travail a démontré la première implication d?un facteur HAP dans l?interaction symbiotique entre les bactéries du sol appelées Rhizobia et les légumineuses. Celle-ci culmine dans la formation d?un nouvel organe sur les racines de la plante hôte appelé nodule au sein duquel l?azote atmosphérique est fixé au bénéfice de la plante. Par transcriptomique nous avons identifié MtHAP2a comme un gène spécifiquement induit au cours des étapes précoces de la nodulation et exprimé dans la zone méristematique des nodules matures. Nous avons établi que MtHAP2a était le gène HAP2 majoritaire dans les nodules même si d?autres sont également exprimé dans cet organe. Par RNAi et à l?aide d?un mutant KO nous avons pu montrer que MtHAP2a jouait un rôle central dans la signalisation symbiotique et le maintient du méristème nodulaire. Le but de ce projet est de comprendre le réseau de régulation par lequel MtHAP2a contrôle plusieurs étapes clés de la nodulation en identifiant à la fois ses interacteurs protéiques et les gènes cibles dont il régule la transcription. Le projet s?articule en trois tâches Tache 1 : Il s?agit de caractériser les gènes HAP exprimés dans les nodules, d?abord en déterminant leur profil d?expression tissulaire par hybridation in situ d?ARNm. On pourra ainsi identifier des gènes MtHAP2 au profil potentiellement complémentaire ou additif de MtHAP2a mais aussi des MtHAP3 ou 5 co-régulés et codant donc pour des interacteurs potentiels au sein de complexes trimériques symbiotiques. Une analyse fonctionnelle par RNAi et recherche de mutant viendra compléter cette étude. Tâche2: Il s?agira d?identifier les partenaires protéiques de MtHAP2a à la fois les HAP3 et HAP5 mais également d?autres régulateurs potentiels. Nous utiliserons le système double hybride pour les tests et les criblages et la bi-molecular fluorescence complementation (biFC) et le Fluorescence Resonance Energy Transfer technology (FRET), ainsi que des expériences de co-localisation par immunocytochimie pour les étapes de validation. Tâche3: Afin d?identifier les cibles nous comparerons le transcriptome du mutant KO MtHAP2a-1, de plantes surexprimant MtHAP2a à l?aide d?un système inductible à la dexamethazone et de plantes sauvages. De manière complémentaire une approche Selex et bioinformatique sera menée. La validation se fera par des expériences de electrophoretic mobility shift assays (EMSA) et immunoprecipitation chromatique (ChIP). En plus de révéler la fonction d?un régulateur symbiotique central ce projet devrait, par la compréhension du rôle méristématique de MtHAP2a, amener des connaissances d?intérêt plus large dans le domaine du cycle cellulaire ou de la différentiation cellulaire au cours de l?organogenèse. Ce projet devrait aussi nous permettre de montrer qu?au-delà de la nodulation les protéines HAP2 végétales fonctionnent comme des modules de régulation connectant différentes voies de signalisation et de développement.