Photocontrôle de protéines à l'échelle de la cellule unique dans un organisme vivant – Applications au développement et à la régénération – PROTEOPHANE

Contexte scientifique et objectifs du projet Le contrôle spatio-temporel de l'expression génétique dans un organisme vivant est un objectif fondamental en biologie. Des systèmes à expression génétique inductible ont été utilisés mais ils pèchent par la technologie de libération de l'inducteur qui devrait idéalement être non invasive, rapide, locale et modulable. Nous désirons mettre en place une technologie remplissant ces critères. Elle utilise des impulsions de lumière infra-rouge et une excitation biphotonique pour libérer un inducteur biologiquement actif par photoactivation d'un précurseur inactif distribué dans l'organisme. Dans ce projet, cette technologie sera mise en œuvre afin d'étudier le processus de développement et de régénération à l'échelle de la cellule dans un organisme modèle vivant : le poisson zèbre. Description du projet, méthodologie Ce projet intègre des contributions en biologie, en chimie et en physique. Les biologistes construiront des lignées transgéniques de poisson destinées au lignage cellulaire pendant la régénération et à l'étude de l'étendue et de la dynamique de l'action des facteurs de transcription (pax6, engrailed) et de la kinase (p38alpha) dont l'activation sera obtenue localement (dans une seule cellule) par décageage d'un inducteur approprié appartenant à la série du tamoxifen. Ces lignées exprimeront un marqueur fluorescent sous l'influence des protéines inductibles (Cre-ERT pour le lignage cellulaire, engrailed-ERT, pax6-ERT, etc.). Certaines lignées existent déjà (ngn1:GFP pour pax6), d'autres sont à fabriquer (Fgf8 :GFP pour engrailed). Par ailleurs des lignées cellulaires seront aussi créées afin de caractériser l'action des protéines de fusion ainsi que leur contrôle par les molécules inductrices synthétisées par les chimistes et de sélectionner les plus efficaces. Les chimistes définiront, synthétiseront et étudieront des groupements protecteurs photolabiles, des inducteurs de la série du tamoxifène et des inhibiteurs de la kinase p38alpha, libres ou cagés. Ils développeront des groupements protecteurs photolabiles remplissant les critères imposés par ce projet. Une étude photophysique et photochimique détaillée in vitro sur des systèmes modèles précédera les expériences in vivo. Il faudra fournir des inducteurs qui pénètrent dans tout l'organisme à l'état cagé, mais qui demeurent retenus dans la cellule cible après photodéprotection. Pour tester ce cahier de charge, les lignées cellulaires mentionnées ci-dessus seront utilisées. Les physiciens développeront un microscope droit polyvalent. Il rendra possible i) des observations en transmission ou en épifluorescence avec différentes sources lumineuses; ii) une excitation locale biphotonique dans la cellule cible. En lien avec ce dernier point, il sera nécessaire de définir et de construire un dispositif approprié d'excitation qui permettra une photodéprotection efficace sans induire de chauffage rédhibitoire résultant d'absorptions résiduelles à un photon des contenus cellulaires à la longueur d'onde utilisée lors de l'excitation biphotonique. Résultats attendus Dans les constructions biologiques finales, la photoactivation permettra de contrôler l'expression génétique dans la cellule cible, tout en la rendant fluorescente ainsi que ses descendantes. Il sera facile de suivre in vivo la prolifération et/ou la migration de cellules activées marquées. Des études par hybridation in-situ nous permettront de suivre aussi l'activation spatio-temporelle attendue des diverses cibles des facteurs de transcription (voire leur auto-activation supposée dans les cellules voisines). Finalement, la dissociation de l'organisme, l'extraction sélective de cellules fluorescentes et l'analyse de leurs transcriptomes/protéomes pourront être effectuées; les examens histologiques pourront ainsi être complétés par des études de profil d'expression génétique. Dans le cas du développement et de la régénération, cette technologie sera unique pour analyser l