Etude, par microscopie à corrélation de fluorescence, de la réponse nucléaire au stress thermique ; aspects dynamiques. – Dynastress

Un des défis actuels de la biologie cellulaire est la compréhension des très nombreux réseaux d'interactions moléculaires qui sous-tendent les processus cellulaires. Habituellement, les interactions se mesurent grâce à des techniques in vitro. Cependant, les développements récents et conjoints dans les domaines de la microscopie confocale et des sondes fluorescentes (protéines de fusion) permettent maintenant d'appréhender, en cellule vivante, tout un ensemble de propriétés dynamiques : mobilité ; interactions ; compartimentation et aggrégation; encombrement ; etc. Sur le plan instrumental, les techniques FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) et FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) font l'objet d'efforts importants : notons que par rapport au suivi de molécule ou de particule unique, la FCS et la FRAP permettent a priori d'accéder à des dynamiques moléculaires plus rapides (car elles n'impliquent pas d'enregistrer des images sur un champ étendu) et fournissent par principe des informations statistiques. Cependant, dans sa mise en œuvre habituelle, la FCS est limitée à des mesures réalisées en une série de points atteints successivement au cours d'un temps d'acquisition long. Le présent projet est basé sur le développement d'une FCS multiconfocale (ou mFCS), qui consiste à collecter simultanément les signaux confocaux issus de différents points d'un environnement cellulaire et à analyser les corrélations de fluorescence pour obtenir des informations moléculaires en ces points. En outre, les méthodes d'analyses statistiques issues de la FCS permettront d'obtenir, à partir d'images plein champ, des informations sur des processus plus lents et ce, par ICS (Image Correlation Spectroscopy) qui intrinsèquement combine corrélation spatiale et temporelle. Les développements instrumentaux se feront autour d'un SLM (Spatial Light Modulator). C'est un système optique qui permet de créer, à partir d'un unique faisceau laser incident, plusieurs spots d'illumination et ce, par diffraction sur un réseau de phase programmable. La même technique originale de contrôle de l'illumination pourra également être appliquée à des mesures FRAP. Au-delà de deux volumes d'observation nous utiliserons pour la détection, plutôt que des APD (Avalanche PhotoDiode), une caméra de type EM-CCD (Electron Multiplied CCD). Cette caméra permettra également d'acquérir, à haute cadence, des images de fluorescence plein champ, en vue d'analyses spatiales et temporelles de type ICS. Ces techniques instrumentales seront appliquées à l'étude des modifications structurales du noyau en réponse à un stress thermique. Nous nous intéresserons au facteur de transcription HSF1 Heat Shock Factor 1 qui se redistribue, lors d'un choc thermique, vers un nombre limité de sites d'accroche granulaires (appelés Nuclear Stress Bodies), ainsi qu'aux modifications de la structure chromatinienne. La réponse au stress est un modèle biologique particulièrement intéressant pour étudier de façon plus générale l'expression des gènes et les modifications de la texture chromatinienne en réponse à un événement extérieur.