Mécanismes de l'activation de la transcription par le Médiateur in vivo. – VivoMed

La transcription est la première étape de l'expression des gènes. En tant que tel, ce processus doit être régulé strictement pour permettre que les programmes génétiques soient réalisés harmonieusement et faire en sorte que la synthèse des composants requis par la cellule à un moment donné dans une situation dévelopmentale particulière soit assurée. Chez les eucaryotes, l'ARN polymérases (Pol) II transcrit les ARN messagers et de nombreux petits ARN non codants. Cette enzyme doit donc répondre aux nombreuses situations auxquelles la cellule se trouve exposée et adapter le niveau de transcription de dizaines de milliers de gènes. Chez les eucaryotes, des centaines, voire des milliers, d'activateurs de la transcription reconnaissant les séquences « enhancers » ou les séquences activatrices amont activent la transcription des gènes adjacents. Un important complexe multiprotéique, le Médiateur de la transcription, ou Médiateur, est responsable du recrutement de la Pol II en réponse aux facteurs de transcription et, en conjonction avec les facteurs généraux de la transcription, de l'assemblage des complexes de préinitiation. Le Médiateur est constitué de 25 sous-unités engagées dans de nombreux contacts au sein du complexe. Le Médiateur interagit également avec des partenaires appartenant à d'autres composants de la machinerie de la transcription, dont les facteurs généraux de la transcription et des co-activateurs modifiant la chromatine, mais aussi des facteurs requis pour d'autres processus du métabolisme nucléaire. Le Médiateur peut donc être comparé à une antenne, capable de recevoir les signaux d'activation au travers de contacts protéine-protéine, de les intégrer, et de déclencher le recrutement de la Pol II et, possiblement, de certains des facteurs généraux de la transcription. Bien que le Médiateur ait fait l'objet de nombreux travaux, sa complexité a empêché la compréhension détaillée des mécanismes par lesquels il répond aux activateurs, de son rôle dans la formation du complexe de préinitiation et de comment, en définitive, il recrute la Pol II in vivo. Les objectifs généraux de ce projet sont, en utilisant Saccharomyces cerevisiae comme modèle, (i) de savoir comment les interactions protéine-protéine au sein du Médiateur transmettent les signaux d'activation depuis les activateurs jusqu'aux facteurs généraux de la transcription et la Pol II ;(i) d'obtenir une compréhension détaillée de la manière dont le Médiateur répond aux activateurs de la transcription in vivo ; (ii) d'identifier les sous-unités du Médiateur qui sont en interaction directe avec la Pol II et de comprendre le rôle de ces contacts; (ii) de comprendre comment le Médiateur et les co-activateurs coopèrent pour activer la transcription. La logique de ce projet est la suivante : Dans un premier temps nous identifierons à l'aide d'une nouvelle méthode de photo-pontage in vivo les sous-unités du Médiateur qui interagissent avec la Pol II. Nous produirons des collections de mutants thermo-sensibles dans les sous-unités essentielles du Médiateur et en particulier celles qui interagissent avec la Pol II. Les effets de ces mutations sur les interactions de ces sous-unités avec leurs partenaires seront étudiés. En parallèle, nous regarderons si ces mutations touchent l'expression de certains gènes par RT-qPCR ou de tout le génome par micro-réseaux ADN. Nous nous attendons à ce que certaines des mutations aient un effet sur l'expression de l'ensemble du génome tandis que d'autres n'affectent l'expression que d'un nombre plus restreint de gènes. Nous chercherons également à connaître l'effet des mutations du Médiateur sur le recrutement du Médiateur lui-même, des co-activateurs, des facteurs généraux de la transcription et de la Pol II sur certains gènes (du régulon méthionine en particulier) ou, dans les cas qui le justifient, sur l'ensemble du génome. Dans ce projet, nous nous concentrerons tout d'abord sur cinq sous-unités essentielles du Médiateur : Med4, Med7