Microscopie FRET In Vivo – FRET INVIVO

L'approche méthodologique utilisant un faisceau de fibre optiques miniaturisé (le Cellvizio®) a permis pour la première fois d'enregistrer de l'activité neuronale à l'échelle cellulaire dans des régions profondes du cerveau. Nous souhaitons maintenant étendre cette approche à la mesure de signaux neuromodulateurs, en utilisant des sondes FRET codées génétiquement. Parmi ces sondes, qui sont des indicateurs d'événement moléculaires très spécifiques, la sonde AKAR2 mesure l'activité de la protéine kinase dépendante de l'AMP cyclique, une enzyme clé dans la signalisation neuromodulatrice dans le cerveau.

Un Cellvizio® sera modifié pour permettre l'excitation et l'enregistrement multi-longueur d'ondes, aux longueurs d'ondes qui seront définies au cours du projet. Un ensemble de logiciels dédiés sera rédigé pour permettre le suivi du signal FRET en temps réel. Après comparaison avec une imagerie plein champ, le système modifié et ses logiciels seront validés sur des préparations de tranches de cerveau.

Le projet scientifique sera développé sur animal vivant : la cascade de signalisation de la PKA sera activée in vivo suite à l'injection IV de cocaine.
//Le caractère innovant du projet tient à chacun de ces 3 points :
- mesure directe d'événements neuromodulateurs dans el cerveau
- imagerie de sondes FRET codées genetiquement
- imagerie Fibrée dans le cerveau profond

La combinaison des trois dans un système capable de réaliser une analyse FRET temps réel avec des moyens de microscopie confocale fibrée est en soi également une innovation.
//Le partenaire 2 dans ce projet a une longue expérience dans les approches des questions de neurobiologie à l'échelle cellulaire. En particulier, ce partenaire a été parmi les pionniers de l'imagerie FRET pour l'étude des signaux neuromodulateurs impliquant la PKA.

Le partenaire 1 dans ce projet est le spécialiste de la microscopie confocale fibrée, pour l'imagerie du petit animal comme pour les applications cliniques.

Les deux partenaires ont une expeérience de collaboration vieille de 3 ans, au cours de laquelle ils ont notamment obtenu les premiers enregistrements de l'activité neuronale à une échelle cellulaire dans le cerveau profond.//Phase 1 :
- Définition quantitatice des exigences systèmes, par une évaluation des signaux disponibles, de leur stabilité, leur SNR au travers d'experiences d'imageries ex-vivo puis in-vivo
- Elaboration des meilleurs protocoles
- Sélection de la meilleure statégie de quantification
- Livraison d'un cachier des charges fonctionnel

Phase 2 :
- Specification technique du système destinés à la microscopie FRET in-vivo, incluant la comparaison entre divers sources LASER, la recherche des bandes spectrales optimales, et la definition des mailleurs algorithmes de calibration et de quantification
- Livraison d'un cahier des charges techniques

Phase 3 :
- Fabrication, codage, integration et tests (AIT) chez Mauna Kea Technologies
- Livraison d'une version preliminaire de l'instrument, avec rapport de tests

Phase 4 :
- Première évaluation ex-vivo puis in-vivo
- Comparaison entre analyse ratiometric temps réel et déconvolution spectrale
- Enregistrement de triplets d'iamges obtenues in-vivo
- Livarsion d'un rapport de validation préliminaire

Phase 5 :
- Optimization du système
- Analyse des limitations observée durant phase 4
- Actions correctives, d'abord sur les specifications, puis sur l'implentation des algorithme de quantification.
- Raffinement et fiabilisation des algorithmes
- Evaluation du potentiel scientific du the project : mesure de la réponse PKA dans le nucleus accumbens après injection de cocaïne.
- Livraison d'un rapport scientifique et d'un rapport de validation final

//Technologie protégée par MKT.
Accord de collaboration signé entre Université P&M Curie et MKT.