– EXODYNAMICS

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : La compréhension des processus biologiques dans les membranes protéo-lipidiques représente un défi majeur car les protéines membranaires représentent 2/3 des cibles des drogues actuelles et elles sont essentielles aux fonctions importantes de la cellule. L'étude structurale des protéines membranaires étant par essence difficile, la connaissance des évènements à un niveau moléculaire est rare. Nous proposons une approche multidisciplinaire afin d'étudier les bases moléculaires d'évènements clés dans les fonctions cellulaires et la fusion membranaire par les protéines SNARE, en nous concentrant sur leur structure, leur dynamique et celle des lipides mais aussi sur leurs fonctions. La fusion membranaire forme la base d'évènements vitaux tel que le relarguage d'hormone ou neurotransmetteur et elle est impliquée dans diverses pathologies. Les protéines SNARE, insérées dans les vésicules ou la membrane plasmique, sont au coeur du processus. Leurs domaines cytosoliques forment un complexe de 4 hélices qui induit la fusion membranaire. Les domaines trans- (TM) et juxta- (JM) membranaires des SNARE semblent essentiels avant le contact des membranes, mais leur role exact est inconnu. Il est donc de première importance de comprendre les interactions entre les domaines TM et la bicouche lipidique. Notre projet combine plusieurs expertises et approches alliant la Biophysique, la Chimie-Physique, la Biomodélisation et la Biologique Cellulaire afin d'étudier cet évènement depuis le niveau moléculaire jusqu'à la fonction biologique. Un travail préliminaire a révélé une dynamique considérable des domaines TM en termes de structure et d'organisation membranaire. 2-Description du projet, méthodologie : Les détails moléculaires des effets de variables pertinentes sur la structure des protéines, leur dynamique, leurs interactions et l'organisation de la membrane seront étudiés en utilisant des modèles simplifiés. Ceci nous permettra de mesurer des évènements simples sur des systèmes construits rationnellement. En parallèle, nous utiliserons la mutation dirigée sur des systèmes modèles ou cellulaires afin d'identifier les paramètres moléculaires des protéines SNARE qui semblent cruciaux pour leur structure, leur dynamique, leurs interactions et leur fonction cellulaire afin de comprendre l'ensemble de ce système rotéolipidique. Nous utiliserons des peptides synthétiques/recombinants de longueur variable. La petite taille des protéines SNARE (100 - 250 AA) autorise des études structurales au niveau moléculaire par des techniques de spectroscopie (IR, Raman, dichroïsme circulaire) en présence de membranes (vésicules reconstituées, bicouches supportées). Avec la spectroscopie IR polarisée (ATR, PMIRRAS) et l'échange isotopique H/D suivi par spectrométrie de masse (HDXMS) nous obtiendrons non seulement la structure mais aussi l'orientation et la position des protéines dans la membrane lipidique. Ceci donnera des informations importantes sur la topologie des protéines dans la membrane mais aussi sur l'effet de variables comme le rapport lipide/protéine ou la composition membranaire. L'utilisation de la modélisation moléculaire pour des dynamiques rapides (~100 ns) procurera des modèles structuraux qui seront ensuite testés par nos techniques analytiques. L'effet des protéines trans-membranaires sur les propriétés de la bicouche qui les entoure sera visualisé par rayons X et AFM . En outre, nous utiliserons une nouvelle approche avec des nano-pointes hydrophobes dévloppées spécialement qui permettent de visualiser les membranes lipidiques avec une résolution nanométrique. L'influence des protéines sur la dynamique de fusion sera suivie par diffusion de la lumière et fluorescence. Leur fonction sera ensuite mesurée par approche biochimique sur cellules vivantes après KO des protéines endogènes et leur remplacement par des protéines naturelles ou mutantes. Des cinétiques à haute-résolution seront obtenues pa