– NOSE

1-Contexte scientifique et objectifs du projet - Ce projet combine les compétences de 3 partenaires dans les domaines de la biologie, de la biophysique, et de la physicochimie, pour explorer les mécanismes fondamentaux de la détection odorante par les Récepteurs Olfactifs (ROs) à l'échelle moléculaire, et pour développer une nouvelle génération de biosenseurs olfactifs. L'acquisition de connaissances recouvre les interactions dynamiques des ROs, OBPs et odorants au sein de complexes fonctionnels et l'état d'oligomérisation des ROs, pour continuer d'élucider les mécanismes moléculaires en termes de liaison, de cinétique, et de compétitions. L'application de biosenseurs sur puce s'attachera à développer une détection odorante à haute sensibilité, par suivi à l'échelle micrométrique de la libération de Golf rapportée dans nos observations préliminaires. L'approche par les nanosomes représente la principale avancée biotechnologique sur laquelle repose le projet. Elle permet les études fondamentales de biophysique et ouvre la route à une nouvelle génération de biosenseurs olfactifs et de nez artificiels avec des performances sans précédent. - - 2-Description du projet, méthodologie - A partir de l'expression fonctionnelle et ajustable des ROs dans des levures génétiquement modifiées, des nanosomes porteurs de ROs fonctionnels sont préparés, qui fournissent les espèces moléculaires naturellement responsables de la réponse olfactive, dans des structures acellulaires préservant leur fonctionnalité, spécificité, et sensibilité. Ceci constitue une nouvelle stratégie au c¿ur du projet. - Deux méthodologies complémentaires, résonance plasmonique de surface (RPS) sur les ROs portés par les nanosomes, et FRET-FLIM sur les ROs en fusion avec des protéines fluorescentes, soit dans les levures entières soit dans les nanosomes, seront impliquées dans l'étude des interactions moléculaires. La RPS détecte la dissociation de la sous-unité Golf induite par la stimulation odorante des ROs pour suivre en temps réel les interactions tripartites ROs-OBPs-odorants, et évaluer le modéle mécanistique que nous proposons. Les modifications spatio-temporelles des interactions entre deux ROs porteurs de marqueurs fluorescents seront suivies par FRET-FLIM, en faisant particulièrement attention à ne pas surexprimer les ROs pour éviter des effets artéfactuels dûs à la promiscuité, et identifier clairement la contribution éventuelle de l'oligomérisation des ROs. Les deux méthodes sont nécessaires pour confirmer ou infirmer nos hypothèses. - Du côté biotechnologique, les nanosomes porteurs des ROs pertinents pour détecter un odorant donné représentent des structures adéquates à manipuler dans des dispositifs microfluidiques pour constituer des biosenseurs sur puce. Le greffage des ROs portés par les nanosomes à des particules magnétiques par des anticorps spécifiques sera envisagé, comme déjà démontré sur d'autres supports. La même mobilisation de Golf mise en évidence par RPS constituera le rapporteur de cette détection odorante, et sera abordée par deux approches complémentaires. Cet évènement sera suivi par une stratégie de FRET ou BRET, impliquant directement soit une récupération de fluorescence, soit une extinction du signal d'espèces marquées en fluorescence. Par ailleurs, une détection immunoélectrochimique indirecte peut être mise en ¿uvre, basée sur la capture spécifique de Golf par un anticorps spécifique et la détection électrochimique. - - 3-Résultats attendus - Des progrès méthodologiques majeurs l'expression ajustable des ROs en levures, le maintien de ROs pleinement fonctionnels dans leur environnement lipidique membranaire jusqu'à l'échelle des nanosomes, et l'évaluation de la réponse fonctionnelle des ROs par la mobilisation de Golf fournissent des outils améliorés et quantitatifs pour s'attaquer aux questions importantes de l'initiation du signal olfactif au niveau des ROs, et de l'évaluation de l'oligomérisation des ROs par des effets de fluor...