– HNSTRUC

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : - La chromatine bactérienne joue, à travers les protéines qui y structurent l'ADN, un rôle clé dans la régulation et l'adaptation des bactéries à l'environnement. Cette adaptation est essentielle pour la virulence et, est bien sur impliquée dans la relation du monde bactérien à l'environnement. Parmi les protéines qui structurent le génome bactérien, la protéine H-NS possède la double fonction de compaction du génome et de régulateur pléïotropique. S. Rimsky vient de montrer que cette protéine possède des sites spécifiques de fixation à l'ADN. Cette notion jusqu'alors inconnue permet d'aborder la relation structure fonction au sein du nucléoïde bactérien de manière tout à fait nouvelle. On peut en particulier cibler les sites spécifiques de fixation sur l'ADN de cette protéine et étudier l'interactome autour de ce site en fonction de l'état physiologique de la cellule. En effet si les partenaires de la chromatine bactérienne sont bien caractérisés, leurs interactions et comment ils s'organisent avec l'ADN reste un domaine inconnu, cependant essentiel pour comprendre la régulation globale chez les bactéries. Les objectifs de ce projet sont: - - la détermination du site consensus de H-NS et ses localisations sur le chromosome - -la caractérisation des interactions protéines/protéines dans les complexes multiprotéiques (oligomères de H-NS ou avec d'autres protéines). Nous caractériserons les partenaires protéiques présents dans la bactérie pouvant interagir avec un complexe spécifique H-NS/ADN (utilisation d'extraits cellulaires) et leur influence sur la transcription. - -la détermination de la structure de H-NS libre ou fixée à l'ADN en utilisant les déterminants du site consensus - -la caractérisation in vivo des complexes spécifique H-NS/ADN, de l'affinité relative d'H-NS pour ses différents sites et leur évolution en fonction des conditions de culture - - 2-Description du projet, méthodologie : - - Dans le cadre de ce projet, nous étudierons la fixation de protéines de la famille H-NS qui possèdent différentes fonctions, parfois antagonistes, par empreintes classiques et empreintes rapides (ms). Nous étudierons les interactions protéine /protéine fixées ou non sur l'ADN et identifierons les zones de contact par pontages chimiques, suivis d'attaque protéasique et spectroscopie de masse. Nous étudierons l'interactome de la protéine H-NS en combinant l'utilisation de l'imagerie de résonance des plasmons de surface et la spectrométrie de masse pour l'identification des partenaires dans les complexes nucléoproteiques. Enfin, nous utiliserons un type nouveau de spectroscopie de fluorescence (spectroscopie de corrélation deux photons, deux couleurs) couplée à de l'imagerie tri-dimensionnelle pour quantifier l'affinité de la protéine H-NS avec ses sites spécifiques in vivo. - - - 3-Résultats attendus : - - Ce projet permettra de déterminer la distribution des sites spécifiques de la protéine H-NS sur le chromosome, et d'identifier les sites spécifiques des protéines de la famille H-NS possédant des fonctions différentes. De même, nous identifierons les contacts protéine/protéine de ces variants, et les comparerons aux contacts établis entre homodimères. Nous caractériserons les structures de protéine de la famille H-NS libres et liée à l'ADN. Nous identifierons l'ensemble des partenaires protéiques qui entrent en jeu dans la régulation par H-NS, en fonction de l'environnement des cellules. Enfin, nous visualiserons et quantifierons in vivo les sites de fixation et l'affinité d'H-NS pour ces sites par spectroscopie de corrélation deux photons, deux couleurs, et ce en fonction de l'état métabolique des bactéries. L'ensemble de ces résultats devrait nous permettre de modéliser la régulation globale chez les procaryotes. - ...