– RhoGTPFLIM

La régulation de la morphologie cellulaire est vitale durant le développement mais aussi à l'age adulte. Dans le cerveau, la réorganisation des synapses, structures riches en actine, pourrait être l'un des processus principaux permettant la mémorisation à long terme. Des expériences sur des neurones en culture suggèrent que la voie de signalisation des Rho-GTPases est un élément clé de régulation des réorganisations à la fois des microtubules et de l'actine. Récemment, des sondes peptidiques ont été mises au point pour visualiser l'activité de cette voie, mais elles n'ont jusqu'à présent été employées qu'en culture cellulaire. L'utilisation de telles sondes dans un organisme entier apporterait de précieuses informations sur de nombreuses fonctions biologiques et en particulier sur des fonctions cognitives telles que la mémoire. - Nous voulons visualiser directement, chez l'animal vivant, les changements moléculaires qui sous-tendent la plasticité synaptique durant l'acquisition et la consolidation d'une information olfactive et établir un lien fonctionnel entre plasticité synaptique et mémoire. Pour y parvenir, nous mettrons en œuvre une nouvelle microscopie de temps de vie en excitation biphotonique capable de quantifier précisément dans l'espace et le temps l'activité FRET de nos sondes dans le cerveau de drosophiles vivantes.
Nous allons introduire les sondes FRET dites Raichu pour suivre l'activité de RhoGTPases Rho, Rac et Cdc42 chez la drosophile. L'expression des sondes sera ciblée dans les corps pédonculés, une structure cérébrale centrale à la fois pour l'acquisition à court et long terme. Les mouches transgénéniques adultes seront montées vivantes et une imagerie de l'efficacité FRET dans le cerveau au cours du temps sera obtenue par microscopie de temps de vie à deux photons. - L'activité des sondes sera en premier lieu vérifiée sur des cultures de neurones de corps pédonculés isolés de cerveau à l'état larvaire et les effets de traitements variés (facteurs de croissance, neurotransmetteurs, stimulation électrique) seront testés. Après un éventuel ajustement des sondes, leur fonctionnalité ayant été confirmée, leur activité sera quantifiée à l'intérieur du cerveau de mouches vivantes, préparées par une technique de microchirurgie qui maintient le cerveau intact tout en ne permettant que de faibles mouvements résiduels. Pour pouvoir analyser des régions relativement profondes du cerveau avec une bonne sensibilité et en évitant les artéfacts dus aux mouvements résiduels et au photo-blanchiment des sondes, une analyse par imagerie de temps de vie de fluorescence après excitation à deux photons sera mise en place. - Ce dispositif sera mis en oeuvre pour suivre la dynamique d'activation des voies de signalisation des RhoGTPase après une procédure de conditionnement olfactif bien validée. Nous espérons alors identifier les traces mnésiques, régions à l'intérieur du centre de la mémoire de la drosophile caractérisées par une haute activité de remodelage cellulaire. Les bases fonctionnelles de cette activité seront testées par interférence ARN contrôlée dans le temps et ciblant des tissus spécifiques. L'imagerie sera complétée par des tests de mémoire par étude du comportement.
Le projet réunit les éléments nécessaires pour établir un lien fonctionnel entre mémorisation et morphologie cellulaire. Il permettra non seulement d'analyser quelles voies moléculaires régulent la plasticité cellulaire dans le cadre de l'apprentissage et du stockage de l'information mais aussi d'examiner au niveau subcellulaire à celui du réseau neuronal la nature de la trace mnésique et cela dans un organisme suffisamment complexe pour qu'il présente différents systèmes et phases de mémoire. Une meilleure compréhension des voies de régulation de la morphologie cellulaire dans le cadre de la plasticité synaptique p