Elaboration de marqueurs fluorescents à 2 Photons optimisés : Application au Traçage d'Acides Nucléiques en milieu cellulaire – EPATAN

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : - Le marquage covalent d'ADN par des sondes fluorescentes est un problème récurrent en biologie. La sonde fluorescente doit en effet à la fois posséder des caractéristiques photophysiques appropriées (rendement quantique élevé et photostabilité) et une taille modeste afin de perturber au minimum les fonctions biologiques. La présence d'un substituant chimiquement réactif est de plus requise pour le marquage. Bien qu'il existe de nombreuses sondes commercialement disponibles ainsi que de nombreuses méthodes de marquage, le choix combiné marqueur marquage constitue encore une étape critique en vue de la réalisation d'un marquage efficace et contrôlé d'ADN natif et pour la fonctionnalisation d'oligonucléotides courts. La microscopie de fluorescence par absorption multiphotonique se révèle désormais être une technique de choix en biologie, notamment pour l'étude non-invasive de la dynamique de la cellule à l'échelle moléculaire. Différents types de marqueurs fluorescents non-linéaires sont actuellement couramment disponibles. Cependant ceux-ci présentent des caractéristiques médiocres (faible section efficace d'absorption, photostabilité réduite), ce qui entraîne une importante limitation des performances de l'imagerie de fluorescence. - L'objectif de ce projet est la mise au point de fluorophores optimisés de la famille des triphénylamines pour le suivi optique des acides nucléiques en milieu cellulaire. Outre l'optimisation du transfert de charges au sein de la molécule, nous étudierons plus particulièrement la possibilité de bénéficier de processus d'exaltation de fluorescence en présence de nano-objets métalliques. - 2-Description du projet, méthodologie : - Ce projet implique trois équipes de recherche complémentaires : (1) une équipe de chimie bioorganique (partenaire 1, M.-P. Teulade-Fichou), (2) une équipe de physiciens (partenaire 2, C Fiorini) et une équipe de biochimistes/biophysiciens spécialisée dans l'imagerie de cellule par microscopie optique (Partenaire 3, P. Tauc). Le partenaire 1 sera chargé de la synthèse de deux séries de fluorophores de la famille des triphenylamines (TPA), spécifiquement conçus pour la fluorescence à 2 photons : i) une série dérivatisée pour le couplage covalent à des biomolécules ii) une série fonctionnalisée pour le greffage sur des nanoparticules métalliques. Le partenaire 2 effectuera la caractérisation des sections efficaces d'absorption à 2 photons des fluorophores TPA synthétisés. Ses efforts porteront par ailleurs sur l'étude approfondie des variations des propriétés d'émission des sondes TPA selon leurs interactions avec le milieu environnant (effets de « quenching » et d'exaltation). La possibilité de bénéficier d'effets d'exaltation de champ en présence de nano-objets métalliques sera plus particulièrement considérée : ces études déboucheront sur des règles de rétro-ingénierie en vue de l'optimisation des caractéristiques photophysiques des sondes. Ces règles seront mises en oeuvre par le partenaire 1 en vue de la synthèse de nouveaux systèmes fluorescents (hybrides fluorophore-particule métallique). Ces résultats pourront également être mis à profit en vue d'une amélioration de la résolution de la microscopie multiphotonique. Le marquage d'ADN natif (plasmides) sera effectué par le partenaire 1 en collaboration étroite avec un partenaire international (E. Weinhold), inventeur d'une nouvelle technologie de marquage enzymatique (SMILling DNA). Le marquage d'oligonucléotides courts (ODN) sera réalisé par le partenaire 1 via les techniques standard de chimie de couplage. Les acides nucléiques fluorescents seront étudiés en cellules par des expériences de transfection et de « FISH » (Fluorescence In Situ Hybridization). La préparation des échantillons cellulaires, le suivi optique, l'imagerie et l'interprétation des résultats seront assurés par le partenaire 3. - 3-Résultats attendus : - 1) Nouvelles règles d'ingénierie de fluorop