Aux sources de l'immunité innée des vertébrés: analyse des défenses antivirales chez l'embryon de danio zébré – ZEBRA-VIRUS

L'embryon de danio zébré est un modèle prometteur pour l'étude de l'immunité innée. Grâce à sa manipulation génétique aisée et à sa transparence optique, il permet l'étude des mécanismes de défenses à un niveau subcellulaire, dans le contexte d'un organisme vivant intégré.
Nous avons développé un modèle d'infection virale de l'embryon de danio. En l'associant aux méthodes de surexpression ou d'inhibition de gènes, nous avons en main un système puissant pour étudier l'immunité antivirale. Nous l'avons déjà montré en identifiant le récepteur de l'interféron du danio par une approche fonctionnelle. Nous souhaitons maintenant étendre ce travail dans plusieurs directions : aux autre cytokines de la famille IFN/IL-10 ; à la recherche de cellules productrices d'IFN spécialisées ; à la description des finTRIMs, une famille de gènes dont nous pensons qu'elles jouent un rôle antiviral important ; et à un criblage fonctionnel parmi les gènes viro-induit conservés chez les vertébrés.
//Ce projet a recours à un noyau de techniques appliquée à l'embryon de danio:
- Gain de fonction : surexpression d'un gène par microinjection au stade 1-cellule, soit d'un plasmide d'expression, soit d'ARNm transcrit in vitro, pour une expression mosaïque ou ubiquitaire ;
- Perte de fonction : suppression d'expression d'un gène, par microinjection au stade 1-cellule d'un oligonucléotide antisens de type morpholino ;
- infection virale par microinjection iv. Nous disposons de 5 virus de familles diverses et de pathogénicité variable. Nous prévoyons de construire un virus couplé à une protéine fluorescente pour suivre l'infection.

En plus de l'IFN-lambda, le danio possède six cytokines de la famille IFN/IL-10. Leurs récepteurs sont constitués de deux membres de la famille CRFB. Nous avons identifié 10 gènes CRFB chez le danio. Pour les attribuer aux récepteurs, nous allons sur-exprimer ou supprimer l'expression des cytokines et des gènes CRFB de façon systématique, comparer les phenotypes induits dans le développement ou en réponse à une infection virale.

Nous allons produire un lignée de danios transgénique stable, avec une GFP membranaire sous le contrôle du promoteur de l'IFN. Les cellules spécialisées productrices d'IFN, si elles existent, seront directement visibles après infection virale.

Nous avons déjà analysé au niveau génomique la vaste famille finTRIM. Nous allons étudier par RACE le répertoire exprimé en cas d'infection virale. L'analyse fonctionnelle fera appel à l'expression de TRIM-GFP suivie d'une infection virale, ainsi qu'à des analyses de colocalisation subcellulaire avec les protéines virales.

Le criblage fonctionnel de l'activité antivirale de gènes viro-induits de fonction inconnue se fera par gain et perte d'expression dans l'embryon puis mesure de l'effet sur l'infection par divers virus. Les gènes candidats seront choisis pour leur conservation au sein des vertébrés.
//- description des fonctions des membres de la famille IFN/IL-10 dans le développement et les infections virales ; identification fonctionnelle de leurs récepteurs.
- réponse à la question de la conservation évolutive des cellules productrices d'IFN spécialisées ; peut-être une première description des cellules dendritiques chez un poisson.
- description de la famille finTRIM et des règles de leur induction après une infection virale ; obtention d'indices sur leur mécanisme d'action.
- identification de nouveaux gènes conservés entre les vertébrés et ayant une activité antivirale.
- production de nouveaux outils pour l'étude de l'immunité antivirale chez le danio : lignées transgénique, virus fluorescent, vecteurs d'expression.