– PIKFAS

"1. Thématique : La voie de signalisation PI3-K (phosphatidylinositol 3-kinase) est constitutivement activée dans de nombreuses cellules leucémiques et dans divers myélomes. Cette voie de signalisation est responsable de l'inhibition du signal de mort déclenché par le récepteur Fas et ce par un mécanisme encore mal défini. Cette voie joue un rôle important dans la leucémogénèse et de plus, est impliquée dans l'échappement tumoral après traitement par des agents anti-cancéreux. Fas appartient à la famille du TNF-R (Tumor necrosis factor Receptor). L'engagement de ce récepteur par son ligand naturel, le FasL déclenche un signal de mort ou apoptose. Les microdomaines ou radeaux lipidiques sont des structures protéo-lipidiques compactes qui flottent dans la bi-couche membranaire cytoplasmique et ces structures concentrent sur leur feuillet intracellulaire de nombreuses protéines de signalisation. La co-agrégation de Fas avec des récepteurs concentrés dans les radeaux lipidiques tel le CD28, induit la re-localisation du récepteur de mort dans ces microdomaines et amplifie considérablement le signal apoptotique dans des cellules tumorales. Récemment nous avons observé que la voie de signalisation PI3-K empêche la relocalisation du Fas dans les microdomaines. - 2. Objectifs et Méthodologie : Nous avons défini 3 objectifs principaux : - Objectif 1) Déterminer les voies de signalisation déclenchées lors de la relocalisation de Fas dans les radeaux lipidiques : - - Co-immunoprécipitation de Fas seul et de Fas/CD28 puis nous comparerons les protéines associées à ces complexes par spectrométrie de masse. Cette étude sera menée en collaboration avec le Pôle protéomique de Bordeaux 2. Les protéines de signalisation associées à Fas lors de sa redistribution dans les radeaux lipidiques et potentiellement responsables de l'amplification du signal de mort seront étudiées plus en détail. - - Etudier l'état de phosphorylation des protéines intracellulaires lors du signal Fas seul ou lors de sa relocalisation dans les microdomaines. Utilisation de puces à protéine développées par le Dr Paul J. Utz (Stanford University, USA) qui permettent de définir un profil précis de phosphorylation de la cellule en utilisant 62 anticorps monoclonaux spécifiques de protéines phosphorylées. - Objectif 2) Dans les lignées leucémiques possédant une voie PI3-K constitutivement activée, l'inhibition de cette voie induit la relocalisation de Fas dans les radeaux lipidiques et le déclenchement d'un signal apoptotique. Notre but va être de déterminer i) le mécanisme moléculaire responsable de la relocalisation de Fas dans les radeaux lipidiques (cytosquelette) et ii) les voies de signalisation déclenchées lors de la redistribution de Fas dans ces microdomaines. - a) Les filaments d'actine ont été impliqués dans le déclenchement du signal apoptotique Fas. La molécule appelée ezrin ponte Fas avec les filaments d'actine. Nous allons générer des molécules d'ezrin tronquées bloquant le pontage Fas/actine. Par microscopie confocale, nous déterminerons i) si le découplage de Fas avec l'actine inhibe la relocalisation du récepteur dans les radeaux lipidiques lors de l'inhibition de la PI3-K et ii) si la mort cellulaire est inhibée. Nous utiliseront aussi des inhibiteurs, perturbant la structure des filaments d'actine (latrunculine A, Cytochalasine D). - b) Les méthodes de puce à phospho-protéines seront utilisées dans le contexte de l'inhibition de la voie PI3-K. Pour être spécifique de cette voie de signalisation, nous allons générer une protéine p85 (sous-unité régulatrice de la PI3-K) bloquant le signal PI3-K. Cette molécule sera fusionnée à un peptide dit perméant appelé la pénétratine qui permet le passage à travers la bicouche lipidique de la protéine cargo associée. Ainsi nous contrôlerons précisément le temps zéro et l'intensité de l'effet inhibiteur sur la voie PI3-K. - c) Les voies de signalisation potentiellement impliquées dans l'amplification du signal apoptotique...