– PROTANIN

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : - Les rôles physiologiques de la salive sont en partie imputables aux protéines salivaires riches en proline (PRP), comportant des séquences répétées riches en proline, glycine et acide glutamique ou glutamine et appartenant à la famille des protéines peu structurées. Parmi elles, les PRP basiques sont particulièrement impliquées dans la précipitation des tanins et les PRP glycosylées dans la lubrification. Les tanins sont des constituants polyphénoliques des végétaux caractérisés par leur capacité à interagir avec les protéines. Ils sont connus pour leurs effets antinutritionels, liés à l'inhibition des enzymes digestives et de l'assimilation des protéines. Ainsi, la synthèse de PRP constituerait un processus d'adaptation à la consommation d'aliments riches en tanins. De plus, les PRP interviennent dans la perception de l'astringence qui pourrait jouer un rôle dans ces mécanismes de défense. Du fait de leur importance pour les qualités gustatives et nutritionnelles des aliments, les interactions entre protéines et polyphénols ont fait l'objet de nombreux travaux. Cependant, ces études sont restées soit très descriptives, soit limitées à des protéines modèles ou à des peptides. Plus généralement, les protéines peu structurées restent peu étudiées, leur rôle fonctionnel n'ayant été admis que récemment et les techniques spectroscopiques comme la RMN et la diffusion de rayons X aux petits angles ne permettant que depuis peu d'analyser leurs caractéristiques structurales et dynamiques en solution. Notre objectif est de caractériser la structure de PRP salivaires humaines et les modifications induites par leurs interactions avec les tanins. - - 2-Description du projet, méthodologie : - Le travail reposera sur des modèles simplifiés comprenant, d'une part les PRP IB5 (basique) et II-1 (glycosylée) toutes deux issues du clivage de la proprotéine salivaire humaine PRB4S, d'autre part l'épigallocatéchine gallate, principal tanin du thé vert, et une série de molécules apparentées représentatives de la variabilité structurale des tanins présents dans les aliments. - IB5 et II-1 ont été obtenues par expression hétérologue, en intégrant au génome de la levure Pichia pastoris le gène de la pro-protéine PRB4S, sécrétées dans le milieu de culture et purifiées. Cette approche permettra également la production de protéine marquée 15N et 15N,13C, pour faciliter les études de RMN. La protéine II-1 déglycosylée, produite par hydrolyse enzymatique, permettra d'étudier l'influence de la séquence primaire et de la glycosylation. - Des approches complémentaires seront mises en ¿uvre pour caractériser tout d'abord les PRP seules, puis les complexes et agrégats PRP-tanins, à différentes échelles. - Les caractéristiques structurales et dynamiques des PRP IB5, II-1 et II-1 déglycosylée, seules ou en interaction avec les tanins, seront déterminées par résonance magnétique nucléaire (RMN). La spectrométrie de masse avec une source d'électronébullisation (ESI-MS) permettra d'étudier la stoechiométrie des complexes et, par des méthodes de fragmentation et d'échange H/D, d'obtenir des informations sur les structures des protéines et des complexes. La diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS) donnera des informations structurales (masse globale, forme et taille des protéines et des complexes en solution, nombre de protéines et de tanins par agrégat) avec une haute résolution. Ces données seront complétées par les mesures RMN des distances interatomiques et des coefficients de diffusion. Enfin, la modélisation moléculaire permettra d'étudier, pour la première fois, les changements conformationels et les mécanismes d'association de ces protéines peu structurées, résultant de leurs interactions avec les tanins. La comparaison de données expérimentales produites par les études RMN et SAXS avec les prédictions générées par la simulation moléculaire permettra de développer ce nouveau champ de recherche. - - 3-Résultats...