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Des travaux récents montrent que le monoxyde d'azote (NO), un des messagers de communication cellulaire parmi les plus étudiés dans les cellules animales, est un médiateur de processus physiologiques variés chez les plantes. Deux voies enzymatiques de synthèse de NO ont été caractérisées: une voie nitrite-dépendante catalysée par la nitrate réductase et une voie L-arginine-dépendante impliquant une activité de type oxyde nitrique synthase (NOS), la principale enzyme catalysant la synthèse de NO chez les animaux. La ou les enzymes catalysant l'activité NOS chez les plantes n'ont pas été clairement identifiées à ce jour malgré l'identification de candidates potentielles. En parallèle, des seconds messagers et des protéines susceptibles de transmettre les effets du NO ont été caractérisés. Toutefois, malgré l'abondance des résultats publiés, de nombreuses questions restent en suspens. En particulier, les mécanismes par lesquels le NO produit de façon endogène guide la cellule végétale vers une réponse appropriée ont été peu abordés. - - Dans ce projet, nous posons l'hypothèse que la spécificité du mode d'action du NO est conditionnée par la nature des enzymes catalysant sa synthèse et la nature de ses cibles moléculaires. Il s'agira donc de réaliser une étude comparative des mécanismes cellulaires contrôlés par le NO chez Arabidopsis thaliana et Medicago truncatula soumis à des stress biotiques et/ou abiotiques. - - Description du projet, méthodologie - - A. thaliana servira de plante modèle pour étudier les fonctions du NO lors des réponses de défense (en réponse au pathogène Erwinia chrysanthemi et à H21, un éliciteur de réaction de défence de nature oligosaccharidique) ou en réponse à l'excès de fer et au stress froid. M. truncatula servira de plante modèle pour étudier l'interaction symbiotique, le micro-organisme Sinorhizobium meliloti ayant été retenu. Une production de NO partiellement sensible à des inhibiteurs de NOS animale a été recensée dans chaque modèle d'étude. - - Pour chaque modèle d'étude, trois axes seront développés : - 1 Identification/caractérisation de ou des enzymes catalysant la synthèse de NO - 2 - Identification de protéines S-nitrosylées et de gènes cibles de NO - 3 Analyse du rôle des cibles moléculaires de NO - - La stratégie retenue pour identifier la ou les sources enzymatiques du NO combinera des approches génétiques, biochimiques et d'expression fonctionnelle. Ces travaux seront notamment focalisés sur l'analyse de l'implication de PAOXs. Ce travail sera complété par l'analyse de mutants sur-exprimant des enzymes piégeant ou métabolisant le NO. Les protéines S-nitrosylées seront identifiées grâce à une approche de protéomique basée sur la méthode Biotin-Switch où les cystéines S-nitrosylées sont converties en cystéines biotinylées. L'impact de la S-nitrosylation sur la fonction des protéines cibles sera étudiée in vivo et in vitro. L'identification des gènes cibles du NO fera appel à des approches transcriptomiques basées sur l'utilisation de micro-arrays. Le rôle des protéines correspondantes sera analysé via des stratégies de génomique fonctionnelle. Une attention particulière sera portée sur l'analyse de la fonction des protéines S-nitrosylées et des gènes cibles de NO associés au métabolisme primaire. - - Résultats attendus - - Ce projet réunit la plupart des équipes françaises intéressées par le rôle de NO dans la réponse de la plante aux stress. Il apportera de nouvelles informations essentielles i) à la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels le NO, produit en réponse à des stress biotiques et abiotiques, oriente la cellule vers une réponse adaptée, ii) quant aux fonctions du NO dans ces contextes physiologiques. En effet, ce projet devrait permettre l'identification d'acteurs clés des mécanismes cellulaires NO dépendants, en particulier de nouvelles enzymes catalysant la synthèse de NO et des protéines cibles du NO. Il devrait également indiquer si NO est