Dynamique Structurale des Protéines Fluorescentes – DSPF

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : Depuis le clonage de la GFP (Green Fluorescent Protein) en 1992, les protéines fluorescentes (FPs) ont pris une importance considérable en sciences du vivant, en tant que marqueurs biologiques. En effet, ces protéines peuvent être fusionnées à de très nombreuses cibles d'intérêt, permettant de suivre localisation et mouvement en temps réel dans la cellule vivante, en fonction des conditions environnementales ou sous l'action d'agents thérapeutiques. Ces dernières années, de nouvelles FPs ont été identifiées chez les anthozoaires (e.g. les coraux formant les récifs des eaux tropicales), qui possèdent des propriétés remarquables de photo-conversion. Ces protéines constituent de nouveaux outils pour étudier la dynamique des cellules vivantes, et laissent espérer des applications biotechnologiques révolutionnaires comme la conception de mémoires de stockage de masse de puissance inégalée. Malgré leur intérêt considérable, les FPs présentent des faiblesses. Par exemple, elles ont tendance à former des oligomères, ce qui rend difficile l'étiquetage de certaines protéines cibles. Elles clignotent , commutant sans cesse entre états fluorescents et états non fluorescents. En outre, les FPs sont rapidement et irréversiblement détruites sous illumination laser, limitant le temps disponible pour les expériences d'imagerie. Ces propriétés intrinsèques, ainsi que les mécanismes de photo-conversion récemment découverts, sont encore mal compris. Devant le développement rapide des techniques d'imagerie de fluorescence, en particulier d'imagerie de molécule unique, il est capital de mettre au point des FPs performantes, monomériques et stables. Ce projet consiste à étudier d'un point de vue structural les mécanismes par lesquels les FPs fluorescent, changent leurs propriétés de fluorescence, ou cessent de fluorescer. Tirant partie d'une meilleure connaissance fondamentale de ces mécanismes, la conception rationnelle de nouvelles FPs sera envisagée puis testée. - - 2-Description du projet, méthodologie : La biologie structurale privilégie actuellement une approche « dynamique » des systèmes vivants. Cette approche sera suivie pour étudier les FPs. Le groupe de « Cristallographie Cinétique des Protéines » (GCCP) de l'Institut de Biologie Structurale (IBS), travaillant en très étroite collaboration avec le synchrotron européen (ESRF), étudie à l'échelle de l'atome les mécanismes structuraux et dynamiques aboutissant à la fonction biologique des protéines. Pour cela, la réaction biologique est déclenchée in situ dans le cristal de protéine et une succession de structures 3D permet de reconstituer un « film » des événements (Bourgeois & Royant, Curr. Opin. Struc. Biol. (2005) 15, 1-10). L'interprétation des résultats est facilitée lorsqu'il est possible de suivre la réaction en parallèle par spectroscopie « in cristallo ». A cette fin, nous avons développé un laboratoire original (le « Cryobench »), permettant d'effectuer des mesures d'absorption, de fluorescence, et de spectrométrie Raman sur les cristaux. Le travail du GCCP sera « encadré » à l'IBS par les contributions des laboratoires d'Ingénierie des Macromolécules (ingénierie, production de protéines), de Dynamique Moléculaire (modélisation) et de Biophysique Moléculaire (radio-biologie, neutrons), assurant la pluridisciplinarité nécessaire à la réussite du projet. L'étude des protéines fluorescentes, objet d'une avalanche de publications ces dernières années, est donc particulièrement adaptée à nos capacités méthodologiques. En outre, le projet est engagé en collaboration avec l'un des laboratoires les plus expérimentés dans le domaine (U. Nienhaus et al, Ulm, Allemagne). - - 3-Résultats attendus : Les structures cristallographiques de plusieurs FPs, dérivées de la GFP et d'origine anthozoaire seront déterminées, y compris par cristallographie aux neutrons, et corrélées avec l'étude sur les cristaux de leurs propriétés spectroscopiques.