– SalsARN

Les petits ARNs non-traduits ont pris leur place parmi les molécules régulatrices les plus importantes et répandues dans tous les organismes. Chez les bactéries, les petits ARNs exercent leur fonction en s'appariant avec des séquences proches du codon d'initiation de l'ARN messager. Dans la plupart des cas, la formation du duplex empêche l'accès du ribosome à l'ARNm, entraînant ainsi l'inhibition de la traduction et la déstabilisation du messager. La protéine chaperonne Hfq participe au mécanisme de régulation par son action de stabilisation du complexe petit ARN-ARNm. Cette stabilisation est d'importance critique car la région d'appariement est généralement courte et ponctuée par des bases mal appariées et /ou non appariées. Les imperfections de la complémentarité pourraient êtres importants pour permettre à un petit ARN donné d'agir de façon pléiotropique sur plusieurs cibles non identiques. Un compromis entre l'efficacité de régulation et l'action pléiotropique est un aspect clé de la fonction des petits ARN chez les bactéries. Ce projet a pour but de disséquer les déterminants de ces propriétés chez des petits ARN représentatifs. Notre stratégie principale impliquera l'analyse de mutations touchant à l'efficacité de régulation ou à la spécificité de cible ou au deux, à l'aide de trois petits ARN différents. - Les petits ARN MicA et RybB s'accumulent pendant la réponse au stress de l'enveloppe ÃE-dépendante et régulent négativement les niveaux des plusieurs protéines de la membrane externe (OMPs). RybB cible plusieurs ARNm tels que ompC, ompD et ompW. Jusqu'à présent, MicA avait été proposé contrôler uniquement ompA. Récemment, notre travail a permis d'identifier l'ARNm de la maltoporine LamB comme étant sous contrôle de MicA (Bossi & Figueroa-Bossi, manuscrit soumis). Un troisième petit ARN, identifié dans notre laboratoire et nommé MicZ, régule spécifiquement une OMP inconnue jusqu'à présent et que nous avons nommé OmpZ. À différence de Mica et RybB, synthétisés suite à des conditions de stress, MicZ est synthétisé constitutivement et responsable du « silencing » complet de ompZ pendant la croissance normale au laboratoire. L'isolement de mutants dans les gènes micA, rybB et micZ et dans les gènes codant pour leurs cibles (lamB, ompC/ompD et ompZ) sera possible grâce à une méthode développée au laboratoire qui marie la mutagenèse aléatoire par PCR à la recombinaison mediée par Red (opéron du phage Lambda). Les mutants sont identifiés au niveau chromosomique à l'aide d'un système de criblage chromogenique basé sur lac. Cette procédée a été testé avec succès de façon préliminaire et ainsi, plusieurs allèles intéressants ont été isolés pour les trois petits ARN. Du fait d'avoir été développée complètement au niveau du chromosome bactérien, notre démarche est nouvelle dans ce domaine, normalement tributaire de l'utilisation de plasmides en multicopie. - Il est proposé de générer une importante collection de mutants qui seront le sujet d'une caractérisation approfondie. Ceci inclura l'analyse de leurs effets sur les niveaux des petits ARN et des ARNm cibles in vivo, sur l'appariement petit ARN-ARNm in vitro (par retardation sur gel et footprinting) et pour certains allèles, sur la capacité de s'associer à Hfq. Dans le cas des petits ARN avec cibles multiples, une attention particulière sera dédiée aux allèles affectés de façon différentielle vis-à-vis des cibles. Dans son ensemble, cette étude devrait conduire à une cartographie détaillée des relations structure-fonction pour les trois petits ARN et renseigner sur les déterminants responsables de la sélectivité de cibles dans le cas de MicA et RybB. - En parallèle, une partie du projet sera dévouée à la caractérisation de certains loci de Salmonella qui montrent une régulation Hfq-dependante (Figueroa-Bossi et al, Mol Microbiol 62 :838-852,2006). Parmi eux se trouve l'opéron malB constitué des gènes malK, lamB et malM. Nos résultats récents indiquent que, mise à part sa par