Détermination des mécanismes d'action et de régulation des protéines de checkpoint Rad53 et Chk2 – Rad53/Chk2

Détermination des mécanismes d'action et de régulation des protéines de checkpoint Rad53 et Chk2 - - 1- Contexte scientifique et objectifs du projet - - Les mécanismes de surveillance ou 'checkpoints' de l'ADN sont des voies de transduction du signal qui coordonnent différentes réponses telles que l'arrêt de la prolifération cellulaire, la réparation de l'ADN ou la mort cellulaire en cas de lésions de l'ADN ou de blocage de la réplication. Ces voies sont particulièrement bien conservées chez tous les eucaryotes et la famille des 'CHeckpoint Kinases 2' (ou Chk2) y joue un rôle essentiel. Cette famille comprend la protéine Rad53 de la levure Saccharomyces cerevisiae et son homologue humain, le suppresseur de tumeur Chk2. Ce projet de recherche associe des études sur le modèle de S. cerevisiae et sur les cellules humaines. Il a pour but d'identifier et de caractériser des régulateurs, positifs ou négatifs, de Rad53 et de Chk2, ainsi que des composants dont elles modifient l'activité, soit directement (leurs substrats), soit indirectement. Plusieurs cribles seront effectués sur Rad53, et nous tenterons systématiquement de transposer les résultats obtenus à Chk2. D'autres études seront menées en parallèle sur les cellules humaines afin d'identifier d'autres partenaires de Chk2 qui n'auraient pas d'homologues chez S. cerevisiae. - - 2- Description du projet, méthodologie - - Chez S. cerevisiae, nos études s'appuieront largement sur les possibilités d'analyse génétique à l'échelle du génome et utiliseront des allèles conditionnels létaux de RAD53 et des mutants rad53 spécifiquement sensibles à des analogues de l'ATP. Les partenaires et cibles de Rad53 seront initialement identifiés par des approches génétiques, et leur caractérisation s'effectuera ensuite par de multiples techniques, génétiques et biochimiques. - Dans les modèles des cellules de mammifère, nous avons déjà transposé les données obtenues au laboratoire chez S. cerevisiae et mis en évidence le rôle de la phosphatase Wip1 dans la régulation négative de Chk2 lors d'un arrêt en phase G2 résultant d'un stress génotoxique. Comme dans notre modèle levure, nous complèterons cette étude en explorant la régulation de la phosphatase Wip1. Nous explorerons ensuite les autres conséquences d'une perte d'activation de Chk2 liée à la surexpression de Wip1, en particulier sur l'arrêt en phase G1, sur les catastrophes mitotiques et sur la réparation de l'ADN par recombinaison homologue. L'inactivation de Chk2 semblant faire intervenir d'autres phosphatases, nous initierons un crible permettant d'une part d'identifier ces phosphatases, et d'autre part d'identifier d'autres régulateurs des protéines de checkpoints. L'impact sur la tumorigenèse de ces régulateurs sera alors étudié. Enfin, comme précédemment, nous tenterons systématiquement de transposer dans le modèle des cellules de mammifère les avancées obtenues dans le modèle levure. - - 3- Résultats attendus - - Les multiples méthodes croisées que nous développons devraient nous permettre d'identifier de nouveaux régulateurs et cibles de Rad53 et de Chk2, dont des interactants directs. Les analyses biochimiques et structurales de ces interactants devraient éclairer les mécanismes moléculaires d'activation et de régulation de ces kinases. Enfin, les analyses globales que nous entreprenons devraient mettre en évidence la participation de certaines voies (connues ou nouvelles) dans la réponse aux dommages de l'ADN. La perturbation des régulations entre ces voies de réponse entraînant des instabilités génomiques, une vision intégrée de ces systèmes à l'échelle cellulaire devrait s'avérer précieuse. - ...