– HpMR

contexte scientifique et objectifs du projet:Les contrôles du pH et de l'homéostasie des métaux sont deux facteurs essentiels à la survie du pathogène humain Helicobacter pylori au niveau de la muqueuse gastrique. Le lien entre ce pathogène et les pathologies gastriques a valu le prix Nobel de médecine en 2005 à B. Marshall et R. Warren. La compréhension des mécanismes d'adaptabilité, de virulence et de résistance au pH acide chez ce pathogène constitue un défi compétitif important. Il a été montré que chez H. pylori, le contrôle du pH et des concentrations intracellulaires en nickel et en fer sont essentiels pour la capacité de colonisation de ce pathogène et sont intimement liés à sa virulence (montré par l'équipe 2 et d'autres). Deux métallorégulateurs Fur (Ferric Uptake Regulator) and NikR (Nickel Regulator) jouent un role central dans ces régulations. Fur et NikR régulent positivement et négativement d'une façon interconnectée l'expression de gènes impliqués dans l'homéostasie des métaux et la résistance au stress acide. Leur rôle et leur mode d'action semblent différents des processus de régulation mieux connus chez E. coli. Ce projet a pour but de mieux comprendre les spécificités de ces métallorégulateurs chez H. pylori, en particulier les mécanismes de régulation directe positive encore incompris et leurs rôles dans le lien entre le contrôle de l'homéostasie du Ni(II) et du Fe(II) et du pH intracellulaire. - Ce projet implique trois groupes qui collaborent déjà sur cette thématique et ont publié ensemble récemment. La force de ce projet est qu'il est authentiquement interdisciplinaire, les trois équipes utilisant des approches différentes pour répondre à une même question biologique. Il comprend (i) des microbiologistes de l'institut Pasteur de Paris (équipe 2) experts dans l'étude de la virulence de H. pylori en particulier son lien avec la réponse à l'acidité et dans l'analyse du rôle de NikR dans cette réponse, (ii) l'équipe de bioinorganique de I. Michaud-Soret (coordinatrice et équipe 1) qui, depuis plusieurs années, étudie au niveau moléculaire, les propriétés de liaison des métaux et de l'ADN des métallorégulateurs Fur et NikR de E. coli, (iii) l'équipe de L. Terradot à l'ESRF qui a récemment résolu les structures cristallographiques de HpNikR apo et métallée de H. pylori. - Description du projet et méthodologie: - Au cours de ce travail nous nous proposons de comprendre: - i) le mécanisme de la répression par Fur et NikR en réponse aux métaux et aux variations de pH en utilisant la région intergénique nikR/exbB où ces deux régulateurs se fixent - ii) le mécanisme de la régulation positive par NikR en utilisant la région promotrice du gène ureA codant pour une des sous-unités de l'uréase, un facteur majeur de virulence de H. pylori - iii) le mécanisme de la régulation positive par Fur en utilisant la région promotrice de fur - Trois approches complémentaires seront utilisées: - a) A l'échelle cellulaire : l'équipe 2 testera chez H. pylori les prédictions fonctionnelles qui concernent à la fois les metallorégulateurs (site de fixation des métaux, effet du pH) et les régions de fixation sur l'ADN qui découleront des études structurales des deux autres groupes. La spécificité de métaux de NikR sera également explorée. Les approches comprendront de la génétique (mutagenèse), de biologie moléculaire et des tests phénotypes (dans différentes conditions de culture et de stress). - b) A l'échelle moléculaire par des analyses quantitatives (détermination de Kd) sur des systèmes purifiés : protéine/ADN/métal par l'équipe 1. Des techniques de biochimie: chromatographie, gels, seront couplées à l'utilisation de techniques spectroscopiques telles que l'U.V.-visible, la RPE et la fluorescence (et anisotropie de fluorescence) à l'équilibre ou résolues en temps (stopped-flow). La caractérisation spectroscopique des espèces métallées sera réalisée. Ces expériences permettront la mise au point de conditions de préparati