Sécrétion non conventionnelle des homéoprotéines – SecHP

Plusieurs facteurs de transcription de la famille des homéoprotéines présentent la propriété inhabituelle de transfert intercellulaire entre cellules. L'homéodomaine, motif de liaison à l'ADN définissant la famille des homéoprotéines, est nécessaire et suffisant au transfert. Ce processus pourrait donc être une propriété partagée par de nombreuses homéoprotéines. Deux études récentes centrées respectivement sur les homéoprotéines Engrailed2 et Pax6 s'accordent pour démontrer une contribution essentielle de la propriété de transfert des homéoprotéines dans la fonction physiologique de ces dernières. Notons que le transfert intercellulaire d'homéoprotéines est aussi observé in vivo chez les végétaux supérieurs. En dépit de différences radicales dans l'organisation multicellulaire des métaphytes et des métazoaires, les modalités du transfert intercellulaire d'homéoprotéines chez les deux phyla présentent de nombreuses similitudes. Ce transfert pourrait donc correspondre à un mode ancestral de communication intercellulaire. - A l'échelle cellulaire, le transfert se caractérise par la sécrétion de l'homéoprotéine suivie de son internalisation dans les cellules adjacentes où elle s'accumule dans les compartiments cytosolique et nucléaire. Sécrétion et internalisation reposent sur des mécanismes non conventionnels. En particulier, les homéoprotéines sont dépourvues de séquence signal de sécrétion conventionnelle nécessaire à l'adressage de la protéine vers la voie Reticulum Endoplasmique/ Golgi. Elles sont de plus localisées majoritairement dans le noyau. Bien qu'impliquant toutes deux le franchissement d'une membrane biologique (dans des sens opposés), sécrétion et internalisation impliquent des motifs distincts au sein de l'homéodomaine, elles peuvent donc être analysées séparément. Nous avons montré que la capacité de sécrétion des homéoprotéines est corrélée à leur adressage dans des compartiments intra vésiculaires et, plus étonnamment, à leur adressage dans le noyau. En effet, la mutation de 3 acides aminés basiques situés dans l'homéodomaine inhibe l'accumulation nucléaire et la sécrétion de ce dernier. Ces deux processus sont restorés par l'addition d'une séquence de localisation nucléaire à l'homéodomaine muté. Notre premier objectif consistera à disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires de la sécrétion des homéoprotéines. Nous analyserons en détail la relation entre noyau et sécrétion. La stratégie expérimentale mise en oeuvre pour l'étude des homéoprotéines présente l'avantage de pouvoir être appliquée aisément à l'étude de protéines de nature différentes et présentant un comportement similaire à l'échelle cellulaire. Le deuxième axe de ce projet consistera en une étude comparative des propriétés de sécrétion non conventionnelles incluant 3 autres protéines (FGF2, Galectin3 et Tat du VIH), toutes trois présentant une forte accumulation dans le noyau. - Le projet comprendra trois approches complémentaires basées sur l'utilisation de lignées stables générées dans les cellules HEK 293 Flp-In Trex. Ces cellules présentent l'intérêt d'assurer une grande reproductibilité entre les différentes lignées qui seront générées grâce à la position invariante du site d'insertion génomique des divers transgènes, et de réprimer l'expression des transgènes en conditions basales limitant ainsi leurs effets indésirables. La première approche consistera en l'analyse comparative de la cinétique d'adressage intracellulaire de ces protéines et celle de leurs variants non sécrétés. A cet effet, les protéines étudiées seront fusionnées à une protéine fluorescente photoconvertible et leur comportement analysé en microscopie confocale sur cellules vivantes. La photoconversion sélective des différents pools intracellulaires de protéine (nucléaire, cytosolique) permettra de suivre de manière spécifique leur devenir au sein de la cellule. La deuxième approche basée sur l'utilisation de protéines de fusion avec une luciférase permettra la