– GEFINHIB

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : Les petites protéines G de la famille Ras (SMGs) sont essentielles dans des processus cellulaires majeurs et sont up-régulées dans un nombre impressionnant de maladies. L'étude de leurs fonctions dans la cellule normale et la recherche de stratégies pour bloquer leur activité pathologique est un défi pour la recherche fondamentale et appliquée et représente un champ de recherches très compétitif. L'objectif de ce projet est de mettre au point une stratégie générale et versatile pour l'inhibition des SMGs par des peptides ou des petites molécules. L'originalité est que la recherche d'inhibiteurs sera ciblée sur les facteurs d'échange (GEFs) dont la fonction est d'activer les SMG en stimulant l'échange GDP/GTP/ Les GEFs émergent actuellement comme des coordinateurs essentiels de l'assemblage de modules de signalisation multiprotéiques contrôlé par les SMGs sous leur forme liée au GTP, et suscitent récemment un grand intérêt comme cibles thérapeutiques à explorer. Il y a de ce fait un besoin urgent de nouvelles molécules pour étudier leur fonction et spécificité dans la cellule normale, et de « leads » pour le développement de médicaments. Sur la base de 3 stratégies innovantes dont les études pilotes ont été réalisées par les équipes participantes, notre objectif est (1) de produire et caractériser un ensemble de nouveaux outils pour étudier la fonction et la spécificité des SMGs et de lerurs GEFs et (2) de mettre au point une stratégie validée pour développer des inhibiteurs de GEFs applicable à des cibles thérapeutiques. 2-Description du projet, méthodologie : Le projet s'intéresse à deux familles de SMG/GEFs : les protéines Rho, qui régulent la dynamique du cytosquelette d'actine et sont impliquées dans la prolifération et la migration tumorale, et les protéines Arf, qui régulent divers aspects du trafic vésiculaire et sont détournées par de nombreux pathogènes bactériens ou viraux, et pourraient jouer un rôle dans l'invasion. Combinant leur expérience dans le domaine des SMGs et des GEFS à leur expertise en biologie structurale (cristallographie et RMN), biochimie des protéines, criblage in silico, biologie cellulaire et études fonctionnelles dans des systèmes intégrés, les équipes caractériseront trois stratégies d'inhibition : (1) criblage d'aptamères peptidiques dans la levure ; (2) criblage de petites molécules au moyen d'un test d'échange reconstitué en 2 hybride dans la levure ; (3) criblage virtuel de petites molécules stabilisant un complexe SMG/GEF abortif selon un nouveau concept, l'inhibition interfaciale. Les études pilotes, réalisées par les équipes participantes, ont permis d'identifier des « hits » pour chacun de ces cribles et assurent la faisabilité du projet. La première partie du projet consistera à évaluer l'efficacité des stratégies par la caractérisation des « hits » : identification des mécanismes d'inhibition ; détermination structurale des complexes drogues/cibles ; évaluation des activités inhibitrices dans des modèles cellulaires ; évaluation des inhibiteurs pour l'investigation des fonctions biologiques dans des modèles in vivo. Sur la base de ces résultats, les technologies seront optimisées et les stratégies et concepts seront étendus à de nouveaux SMG/GEFs cibles. 3-Résultats attendus : 1- Optimisation d'une stratégie générique pour inhiber l'activation des SMGs par leurs GEFs: (a) comparaison des avantages et inconvénients de trois stratégies innovantes ; (b) combinaison des résultats pour mettre au point une stratégie optimisée de découverte de nouveaux inhibiteurs (c) production de nouveaux inhibiteurs complètement décrits et validés (d) identification de « hot spots » pouvant être ciblés dans de futurs cribles. 2- Applications en recherche fondamentale : (a) caractérisation de la spécificité moléculaire et fonctionnelle des RhoGEF et ArfGEF modèles de cette étude et investigation de leur potentiel comme cibles thérapeutiques (b) caractér..