Architecture et dynamique des jonctions adhérentes interendothéliales – celladhesion

L'endothélium vasculaire (VE) est une monocouche de cellules endothéliales qui tapisse l'intérieur des vaisseaux sanguins. Cette barrière semi-perméable régule au niveau des jonctions intercellulaires la transmigration de constituants sanguins variés. L'élaboration de ces jonctions adhérentes qui résulte d'un effet synergique entre les ancres transmembranaires composées de VE cadhérine et le cytosquelette d'actine est un processus très dynamique nécessitant un recrutement séquentiel de plusieurs protéines (VE cadhérine, catenines et filaments d'actine). Ce processus débute par la croissance de protrusions ou filopodes initiée par une polymérisation locale d'actine. Les complexes VE cadhérine/caténine qui sont exposés à l'extrémité des filipodes d'une cellule sont propulsés vers la cellule adjacente. Ils vont élaborer des interactions homophiliques ce qui va donner naissance à des jonctions nouvelles. La structure et les propriétés dynamiques (incluant les interactions cadhérine /filaments d'actine) des filipodes et des jonctions adhérentes restent encore mal connus alors que les filaments d'actine sont bien caractérisés sur les plans structural et dynamique. Aussi, la connaissance de la structure de la VE cadhérine, ses capacités d'autoassemblage et d'interactions avec le cytosquelette d'actine restent à élucider pour mieux appréhender la formation des jonctions adhérentes. Les objectifs sont (i) l'étude de la structure 3D et de la dynamique des filopodes, (ii) la détermination de la structure à l'échelle atomique de l'auto-assemblage de la VE cadhérine (iii) la reconstruction 3D de jonctions adhérentes artificielles et (iv) la construction d'un modèle 3D de jonctions adhérentes natives. 2-Description du projet, méthodologie : Une approche structurale du moléculaire au cellulaire est requise pour une compréhension complète des mécanismes impliquant les différents complexes dans la construction des jonctions adhérentes. Sur le mode de la Biologie Intégrative, le projet consiste en : 1.- Etude de la formation des filopodes, structures engagées dans la phase précoce du processus d'adhérence cellule-cellule. La vidéo microscopie de fluorescence permettra d'aborder la dynamique de leur croissance à partir de cellules en culture. Leurs architectures 3D seront déterminées par cryotomographie électronique (cryoET) après détermination des conditions expérimentales de culture cellulaire sur grille de microscopie. 2.-Etude des jonctions adhérentes natives du niveau moléculaire au cellulaire A- Production du fragment de VE cadhérine contenant les modules extracellulaires EC1 à EC4 (VE EC1-4) qui forme un hexamère en solution B- Détermination d'un modèle atomique de l'hexamère du fragment VE EC1-4 par diffraction aux rayons X. Les conditions pour produire des cristaux 3D de VE EC1-4 qui aujourd'hui diffractent à 4Å seront optimisées pour atteindre une résolution 3.3 Å afin de permettre de résoudre la structure. Une approche en cryo-microscopie électronique et analyse d'images permettra également de calculer une structure 3D de l'hexamère, information utile pour déterminer la phase des données cristallographiques. C- Détermination de la structure 3D de jonctions adhérentes artificielles reconstituées in vitro par auto-assemblage des hexamères sur des membranes lipidiques en utilisant la cryoET afin de mieux comprendre la contribution de l'ectodomaine de la VE cadhérine dans la formation des jonctions adhérentes. D- Reconstruction 3D par cryoET de jonctions natives à différents stades de leur maturation. E- Etude de la dynamique des jonctions natives par vidéo microscopie de fluorescence en se focalisant sur les protéines associées à l'actine et sur leurs interactions avec les complexes VE cadhérine /caténines. 3-Résultats attendus : En obtenant le premier modèle atomique du VE EC1-4, les points structuraux spécifiques de la VE cadhérine et par voie de conséquence des cadhérines de type II pourront être mis en évidence. Avec l'intégrati..