Modifications épigénétiques héréditaires induites par les ARNs et microARNs chez la souris – PARAMIR

Le projet s'inscrit dans trois champs de recherche récemment ouverts, incluant l'établissement et la transmission héréditaire de modifications épigénétiques chez l'animal, la transmission par le père d'une information épigénétique question récemment ouverte par la découverte des ARNs du spermatozoïde, enfin le rôle d'ARNs et en particulier de microARNs dans l'induction de modifications épigénétiques. Nous avons décrit très récemment une variation épigénétique héréditaire affectant le locus Kit de la souris (Rassoulzadegan et coll., Nature, 2006), analogue à l'exemple paradigmatique étudié chez les plantes sous le nom de paramutation. La souris génétiquement homozygote sauvage Kit+/+ dérivée d'au moins un parent hétérozygote pour la mutation KittmlAlf (insertion d'une séquence lacZ dans le premier intron) maintient le phénotype caractéristique du mutant (queue et pattes blanches) et le transmet à sa descendance. Le phénotype « paramuté Kit* » correspond à un niveau réduit du messager. Celui-ci est dû à la formation de molécules d'ARN non polyadénylées de tailles multiples (épissage déficient ou coupures post-transcriptionnelles), et non à une diminution de l'activité transcriptionnelle. Cette dernière est au contraire accrue aux stades terminaux de la différenciation germinale mâle (spermatides) auxquels le gène est normalement éteint, aboutissant à l'accumulation d'ARN dans le spermatozoïde mature. Un rôle dans la transmission du phénotype paramuté est montré par le résultat de la microinjection de ces ARNs de sperme dans l'œuf fécondé, la majorité des souris produites par les embryons traités montrant et transmettant à leur descendance la modification épigénétique. Le même résultat est obtenu par injection dans l'œuf des microARNs spécifiques du locus Kit miR-221 et 222. L'injection d'autres microARNs produit des modifications distinctes, toujours héréditaires. L'une des plus remarquables est l'accélération de la croissance et du développement psychomoteur et sexuel chez les souris nées après microinjection de miR-124 (localisation cérébrale). A tous les âges, les souris sont 20-30 pour cent plus grandes que les témoins et atteignent plus tôt la maturité sexuelle. Le projet pose les questions suivantes. Première partie : à propos de la paramutation Kit*. 1. Rôles respectifs des ARNs Kit normaux et miR dans la paramutation L'apparition de la modification épigénétique a été observée dans trois conditions : chez l'hétérozygote KittmlAlf, après injection des ARNs de celui-ci, notamment du spermatozoïde (qui contiennent des formes anormales courtes, mais dans lesquels la présence des miRs reste à rechercher), après injection des miRs. Quel(s) est(sont) le ou les inducteurs ? - Distribution des miR-221 et -222 dans les cellules somatiques et germinales des souris Kit* et des hétérozygotes tm1Alf. - Profils des miR-221 et -222 au cours du développement après leur microinjection au stade 1. - Analyse des formes anormales courtes d'ARN Kit dans les cellules somatiques et germinales (dérivation de formes épissées ou d'un transcrit primaire ? coupures préférentielles ?...) - Microinjection des ARNs courts définis ci-dessus. - Leur apparition après microinjection des miR-221 et -222. - Effets de l'expression ectopique à partir de transgènes de Kit et des miRs correspondants, notamment expression ciblée sur la lignée germinale. 2. Recherche de modifications covalentes de l'ADN et des histones qui seraient associées à l'état modifié. 3. La paramutation est-elle la conséquence d'un défaut d'appariement des allèles : tests d'autres mutants par insertion et de mutants ponctuels. Deuxième partie : caractérisation des « géants miR-124» 1. Bilans hormonaux, tests physiologiques et neurologiques effectués par l'Institut Clinique de la Souris (Illkirch). 2. Recherche des gènes cibles, d'après les résultats obtenus en 1 et par analyse du transcrptome sur puces Affymetrix. 3. ARNs dans les cellules germinales, ARNs du spermatozoïde. Questions g.