Specific Inhibitors of Aminoglycoside Modifying enzymes – SIAM
Inhibiteurs spécifiques d'enzymes inactivant les aminoglycosides
Inhibiteurs spécifiques d'enzymes inactivant les aminoglycosides
objective
Sur la base de notre connaissance des structures et spécificités des enzymes de modification des antibiotiques APH, nous proposons de concevoir des inhibiteurs spécifiques capables de restaurer la sensibilité bactérienne aux aminosides sans affecter les kinases humaines. Le projet s'appuie sur des études préliminaires de conception de médicaments qui ont permis au coordinateur français (P1 Guichou) d'identifier plusieurs petites molécules inhibitrices ayant un motif chimique commun. Ces fragments ont été co-cristallisés avec des APH de différentes bactéries. Ils ont une efficacité de ligand très élevée et inhibent l'activité enzymatique in vitro dans la gamme du micromolaire. Sur la base des structures tridimensionnelles obtenues par co-cristallisation, le coordinateur allemand (P2 Hausch) synthétisera chimiquement, de manière itérative, des dérivés améliorés de ces fragments dans le but d'obtenir une inhibition puissante contre un large éventail d'APH, mais pas contre les kinases humaines. Le mode de liaison sera déterminé par cristallographie aux rayons X par le coordinateur français qui réalisera également les tests d'inhibition de l'activité enzymatique et les prédictions par modélisation (sélectivité pour les APH par rapport aux kinases humaines). Un deuxième partenaire français (P3 Lavigne) testera in vitro les nouveaux composés pour leur capacité à restaurer la sensibilité aux antibiotiques sur une collection de souches cliniques multi-résistantes de Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae, en particulier celles exprimant des APH. Un deuxième partenaire allemand (P4 Rox) analysera la cytotoxicité des composés nouvellement synthétisés, déterminera leurs propriétés ADME, ainsi que leurs propriétés pharmacocinétiques, puis testera leurs effets sur des modèles animaux d'infections pulmonaires.
WP1 Définition des spécificités du site de liaison nucléotidique des APH
WP2 Optimisation chimique des inhibiteurs leaders d'APH
WP3 Caractérisations in vitro de nouveaux inhibiteurs d'APH
WP4 Tests in vivo de nouveaux inhibiteurs d'APH
WP1 Définition des spécificités du site de liaison nucléotidique des APH
1.1 Modélisation moléculaire des APH pour concevoir des inhibiteurs pan-APH : l'identification des acides aminés conservés dans la famille des APH a été réalisée par comparaison des séquences après alignements structuraux et a été utilisée pour guider l'optimisation des inhibiteurs.
1.2 Comparaison in silico avec les kinases eucaryotes : l'interaction des inhibiteurs optimisés proposés avec le kinome humain a été réalisée.
WP2 Optimisation chimique des inhibiteurs leaders d'APH
2.1 Exploration SAR de la partie sud (en vert sur la figure ci-dessous) : les quelques variations réalisées sur la position 5 suggèrent la préférence suivante : Cl > Br > Pyrazole.
2.2 Exploration SAR de la partie nord (en rose)
2.3 Exploration SAR de la partie est (en jaune)
Pour ces deux stratégies, les synthèses par le Partenaire 2 des composés suggérés ont échoué. D'autres alternatives ont été proposées par le Partenaire 1 (voir figure ci-dessous).
Seuls 5 composés ont été synthétisés au lieu des 48 prévus.
WP3 Caractérisations in vitro de nouveaux inhibiteurs d'APH
3.1 Inhibition des APH purifiées : Le Partenaire 1 a purifié 8 APH et les a utilisées pour les tests in vitro des inhibiteurs optimisés.
~ 3.2 Détermination des interactions moléculaires avec les APH : la structure de 2 APH en complexe avec l'inhibiteur leader a été obtenue par le Partenaire 1. La détermination de la structure d'autres APH en complexe avec ce composé est en cours.
~ 3.3 Identification de kinases hors cible : faible inhibition et détermination de la structure d'une potentielle kinase hors cible avec le meilleur composé leader (position inversée).
~ 3.4 Sensibilité aux aminosides des bactéries MDR : des bactéries MDR exprimant des APH ont été sélectionnées par le Partenaire 3. Les tests de sensibilité aux antibiotiques sont en cours.
3.5 Test de cytotoxicité : pas de cytotoxicité de l'inhibiteur leader démontrée par le Partenaire 4.
~ 3.6 Profilage ADME d'inhibiteurs d'APH sélectionnés : Small ADME pour 24 composés, Full ADME pour 1 composé par le Partenaire 4 sont reportés suite aux problèmes de synthèse de nouveaux composés.
WP4 Tests in vivo de nouveaux inhibiteurs d'APH : tous ces tests seront retardés pour les raisons évoquées ci-dessus, et probablement revus à la baisse.
Notre principal composé actuel montre une très bonne activité in vitro sur plusieurs APH retrouvés dans des bactéries pathogènes pour l'homme et classées en priorité 1 par l'OMS. Ce composé n'est pas toxique pour les cellules eucaryotes et il présente une excellente stabilité dans les fluides physiologiques. Il est capable de restaurer la sensibilité à la gentamicine de souches d'E. coli de laboratoire surexprimant des APH.
none
Multidrug resistance (MDR) is a major public health problem requiring urgent development of new antibiotics, as pointed out by the World Health Organization. Modification of aminoglycosides by bacterial enzymes is the major source of resistance against this class of antibiotics. Protein kinase inhibitors, that also inhibit one class of these bacterial enzymes (aminoglycoside phosphotransferases), have been shown to be efficient to restore the sensitivity to aminoglycosides of MDR bacteria. However, because these protein kinase inhibitors primarily target human kinases they might have undesirable side effects preventing their clinical use as drug to restore sensitivity to antibiotics.
Based on our knowledge of the structures and specificities of aminoglycoside modifying enzymes (specifically differences such as Pro76 of APH(2")-IVa which is conserved amongst APHs), we propose to engineer specific inhibitors able to restore the bacterial sensitivity to aminoglycosides without affecting human kinases. To assure minimal effects on human kinases, a counter screen will be performed routinely. The project relies on preliminary fragment-based drug design studies that allowed the French coordinator (Guichou) to identify several small molecule inhibitors with a common scaffold. These fragments have been co-crystallized with one of these enzymes, have very high ligand efficacy and inhibit its in vitro activity in the micromolar range. Based on the co-crystal structures, the German coordinator (Hausch) will chemically synthesize in iterative rounds improved derivatives with the aim to achieve potent inhibition against a broad panel of bacterial kinases while differentiating against human kinases. Binding mode determination by X-ray crystallography, enzyme activity inhibition and prediction by modelling (selectivity for bacteria vs human kinases) will be performed by the French coordinator. A second French partner (Lavigne) will test in vitro the new compounds for antibiotic sensitivity restoration on a collection of MDR clinical strains of Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, especially those expressing aminoglycoside modifying enzymes. A second German partner (Rox) will assay the cytotoxicity of the newly synthesized compounds, determine their ADME as well as pharmacokinetic properties and then test their effects in animal models of lung infections.
The collaborative work of this multidisciplinary and complementary consortium joins the French and German expertises in this field and will pave the way to fight against aminoglycoside resistance and finally open up new treatment options for immuno-compromised patients suffering from lung infections caused by MDR Acinetobacter, Pseudomonas, Escherichia and/or Klebsiella.
Project coordination
Jean-François Guichou (Centre de Biochimie Structurale)
The author of this summary is the project coordinator, who is responsible for the content of this summary. The ANR declines any responsibility as for its contents.
Partnership
CBS UMR5048 Centre de Biochimie Structurale
VBMI Virulence bactérienne et maladies infectieuses
Technische Universität Darmstadt
HZI Helmholtz Centre for Infection Research
Help of the ANR 392,993 euros
Beginning and duration of the scientific project:
October 2019
- 36 Months
