Multiscale approaches to characterize Cellular Interaction, Trophic transfer and TOXIC impacts of metallic Nanoparticles in aquatic organisms – CITTOXIC-Nano

Les mécanismes d’internalisation et de toxicité des NP sont abordés in vitro par l’utilisation de cultures primaires de cellules d’artères pulmonaires humaines pour lesquelles des inhibiteurs de différentes voies d’endocytose sont connus. Ces méthodes sont transposées à des cultures primaires d’hémocytes de bivalves et à des lignées cellulaires de foie de poissons pour lesquelles ces outils sont encore très peu développés. In vivo, les impacts toxiques sont étudiés à l’échelle moléculaire par la mesure du niveau d’expression de plusieurs gènes d’intérêt qui ont au préalable été caractérisés chez les espèces cibles (diatomées) ou utilisant la technologie récente du séquençage haut débit du transcriptome (bivalves, poissons). Ces nouvelles technologies permettent de caractériser les réponses précoces des organismes même à très faible dose d’exposition, n’entrainant pas forcément de bioaccumulation dans les tissus, et révélant ainsi les potentiels effets générés en milieu naturel. Le transfert et les impacts associés aux NP sont également étudiés le long de leur transit dans des chaines trophiques simplifiées à deux et trois maillons, respectant des conditions naturelles d’exposition. Ces études sont complétées par de l’imagerie in vivo permettant, grâce à la synthèse de NP fluorescentes, de localiser le trajet des NP lors d’une exposition par la voie directe (eau) ou par la voie trophique (nourriture) sur animal vivant. Enfin, des enquêtes menées auprès des ménages permettent d’identifier les produits domestiques à usage courant susceptibles d’être source de rejets dans les milieux aquatiques

Les principaux résultats obtenus in vitro montrent une influence de la taille et de la charge des NP sur les effets toxiques engendrés, mais ceux-ci diffèrent d’un type cellulaire à l’autre. Les AgNP se révèlent être plus toxiques que les AuNP. Pour les diatomées, une sensibilité particulière de certaines espèces a été constatée face aux NP, avec une induction de gènes impliqués dans la lutte contre le stress oxydant, malgré une absence de bioaccumulation. Grâce à une collaboration mise en place avec l’USGS de Californie, des expérimentations de modélisation biodynamique ont pu être développées. Celles-ci ont mis en évidence que les bivalves accumulent 2 à 10 fois plus l'Ag que l'Au sous forme NP et jusqu'à 100 fois plus sous sa forme ionique. Par contre, les AuNP génèrent plus d’impacts au niveau génétique que les AgNP, malgré leur faible accumulation. Concernant le modèle poisson, le taux de transfert trophique des AuNP à partir d’une nourriture artificiellement enrichie s’est révélé extrêmement faible. Cependant, malgré l’absence d’accumulation de NP dans les anguilles, des impacts ont été mis en évidence par séquençage haut-débit du transcriptome du foie et du cerveau. Les gènes différentiellement exprimés (respectivement 258 et 156) sont impliqués dans la réponse à un stimulus, la mort cellulaire mais surtout dans le système immunitaire et l’inflammasome. Une expérience plus récente à l’aide de nourriture « naturellement contaminée » a mis en évidence un transfert trophique significatif d’Au chez les anguilles, mettant en évidence l’importance des processus biologiques dans la biodisponibilité et le transfert des NP. Enfin, des expérimentations de relargage d’Ag suite au lavage de chaussettes de sport contenant des AgNPs ont pu mettre en évidence le risque de dispersion de ces nanomatériaux vers le milieu aquatique.

Les résultats obtenus jusqu’à présent vont être confrontés à ceux obtenus après exposition à des nanoparticules manufacturées de manière à observer si les outils développés dans ce travail pourront être généralisables aux NP métalliques dans leur ensemble. De plus, l’impact de NP fluorescentes couramment utilisées dans les approches de toxicité, comparativement aux NP de même nature sans fluorochrome permettront de préciser si celles-ci induisent des effets toxiques plus importants que des NP non fluorescentes. Enfin, l’estimation des rejets de NP issus des produits courants à usage domestique permettra de mettre en regard nos résultats avec les expositions réelles des organismes en milieu naturel

Les premiers résultats de ce projet ont permis de publier deux articles dans ESPR sur les mécanismes d’interactions des AgNP avec les biofilms diatomiques. Deux autres articles sont parus dans ESPR sur la synthèse d’AuNP par les diatomées et la capacité de transfert et les impacts toxiques des AuNP lors de chaines trophiques expérimentales à deux maillons. Un cinquième article est actuellement soumis dans ETC. Plusieurs communications lors de congrès internationaux (SETAC, SEFA, EMC, ICEENN, SCPB, …) ont déjà été données (2 oraux et 6 posters)

This interdisciplinary project aims to study for the first time the behaviour, the interactive capacity, the internalization, the toxic impact and the trophic transfer of functionalized metallic nanoparticles (NPs), considered as models of NPs potentially encountered in natural ecosystems, in aquatic organisms. Besides their broad use in biotech industries, their physical and chemical specific properties present assets making them trackable in laboratory experiments in order to evaluate the nature of interactions and possible toxic impacts in the different biological compartments, and to forecast environmental consequences along trophic webs in freshwaters. Therefore different strategies at different levels of organization (molecular, cellular, organism and trophic chain) are proposed to study the biological impact of gold (Au) and silver (Ag) NPs in various freshwater organisms (periphytic diatoms, bivalve molluscs and fish). Developments in terms of NPs synthesis and characterization will be first conducted to propose different types of NPs in size, shape, coating and charge, adapted to the different proposed experiments. New molecular targets of the transcriptome of organisms studied will be developed, notably on diatoms and bivalves to extend the possibilities to understand the mechanisms of action of NPs towards aquatic organisms. The NPs interactions with different cell types (diatoms, bivalve hemocytes and eel hepatocytes) will be studied in order to quantify the functional groups implied in NPs fixation and also to characterize the mechanisms of internalization of these particles by cells in culture. At the organism level, the bioaccumulation of NPs will be quantified by metals analysis in the different organs, and the tissue and intra-cellular localization of the particles will be determined by correlative microscopy (optical, confocal, fluorescence and transmission electron) and 2D and 3D X-ray based imaging techniques. Toxic impacts generated by these particles will be also assessed by histology analyses, quantification of proteins implied in the metals detoxification, gestion of oxidative stress, and quantitative analysis of gene expression implied in different functions (oxidative stress, detoxification, mitochondrial metabolism, apoptosis, genotoxicity). Trophic transfer of metallic NPs between periphytic diatoms and organisms such as fish will be then studied, with two to three levels of trophic transfer. The final consumer of this chain will be the carnivore European eel Anguilla anguilla on which in vivo ingestion of AuNPs labelled by a fluorescent probe will be studied by fluorescence imaging and toxic impacts by the use of a DNA microarray. The construction of this microarray of around 1000 genes is currently developed in our laboratory in another project (International ANR IMMORTEEL France/Québec), and it will allow us to characterize the gene expression pattern specific to NP exposure and to precisely define the mechanisms of toxicity involved in fish in relation with the accurate location and quantification of NPs at the tissue and cellular levels. Finally, considering the incorporation of NPs into consumer products and domestic sources accounting for a significant dispersion of NPs into ecosystems, the Human Ecology approach, especially the family ecology approach, will aim to identify which consumer products are concerned, to clarify their use and to assess NPs outputs, in order to link the use of consumer products and the ecotoxicological impacts in aquatic ecosystems. All these different approaches will help us to realize a complete diagnosis of the attacks and impacts which might be expected in aquatic organisms and along the trophic web, after a contamination by Au or AgNPs.