Molecular and physiological bases of the circadian clocks- metabolic homeostasis interactions – CHRONOMET

Mouse genetics
Methods for circadian physiology
Methods for metabolic physiology
In situ hybridization
Fonctiona lgenomics and metabolomics

Modèle de délétion foie spécifique de KLF10. Nous avons en particulier importé grâce à notre collaboration avec le laboratoire de Thomas Spelsberg aux USA, des souris qui porte un allèle floxé du gène Klf10. Nous avons également importé du même laboratoire des animaux knockout pour le gène Klf11, lui aussi impliqué dans le métabolisme énergétique. L’IGBMC de Strasbourg nous a également fourni une lignée de souris exprimant une recombinase CRE conditionnelle spécifiquement dans le foie grâce au promoteur de l’albumine sérique (SA-CRE-ERT2). La première étape a consisté a confirmé que dans nos conditions expérimentales cette lignée était capable de générer une délétion dans le foie. Nous avons pour cela croisé ces souris avec une lignée reporter mTmG. Les animaux positifs pour le gène rapporteur et la CRE hépatique ont alors été injectés avec du tamoxifène et des coupes de tissus en été analysées en microscopie confocale une semaine après l’injection. Nous avons maintenant confirmation que l’injection d’une seule dose est suffisante pour déclencher excision de la séquence floxée et cela spécifiquement dans le foie. En parallèle, des animaux mutants pour l’allèle Klf10 floxés ont été générés et croisés avec des animaux SA-CRE-ERT2. Une seconde étape de croisement des doubles positifs issus de ces croisements a été réalisée avec des animaux homozygotes pour l’allèle floxé Klf10. Cette stratégie nous permet d’obtenir des animaux Klf10fl/fl SA-CRE-ERT2. Nous venons d’obtenir un premier lot expérimental avec lesquels les premières analyses du phénotype métabolique vont être réalisées.

Dans les 12 prochains mois, nous allons être en mesure de produire des groupes expérimentaux d'animaux chez les lesquels KLF10 sera absent spécifiquement dans le foie. Ces animaux vont être exploités pour déterminer leur phénotype métabolique et circadien. Nous prévoyons de réaliser les tests de tolérance fonctionnels classiques, des proflilage de RNA et d'initier une étude de métabolomique dans le cadre d'une collaboration avec une équipe Japonnaise experte dans le domaine.
Une autre partie des effort sera consacrée à la cartographie de l'expression de KLF10 dans le cerveau.
Enfin le volet ChIP-seq bien que retardé du à des aléas techniques, sera poursuivi.

1: Delezie J, Dumont S, Dardente H, Oudart H, Gréchez-Cassiau A, Klosen P, Teboul
M, Delaunay F, Pévet P, Challet E. The nuclear receptor REV-ERBa is required for
the daily balance of carbohydrate and lipid metabolism. FASEB J. 2012
Aug;26(8):3321-35. doi: 10.1096/fj.12-208751. Epub 2012 May 4. PubMed PMID:
22562834.


2: Teboul M, Delaunay F. [Nuclear receptors REVERBa and REVERBß set the clock].
Med Sci (Paris). 2012 Aug-Sep;28(8-9):689-92. doi: 10.1051/medsci/2012288005.
Epub 2012 Aug 22. French. PubMed PMID: 22920865.


3: Goumidi L, Grechez A, Dumont J, Cottel D, Kafatos A, Moreno LA, Molnar D,
Moschonis G, Gottrand F, Huybrechts I, Dallongeville J, Amouyel P, Delaunay F,
Meirhaeghe A. Impact of REV-ERB alpha gene polymorphisms on obesity phenotypes in
adult and adolescent samples. Int J Obes (Lond). 2013 May;37(5):666-72. doi:
10.1038/ijo.2012.117. Epub 2012 Jul 17. PubMed PMID: 22828941.

Metabolic diseases have reached an epidemic dimension. This increase is alarming since obesity and diabetes in addition to be severe pathologies represent risk factors for development of cardiovascular diseases and cancer. Increasing evidence suggests that the circadian system which synchronises our physiology with the light/dark cycle is intimately linked to metabolic homeostasis. Epidemiological data show for example that alterations of circadian system caused by shift work (17% of working population in France) are correlated with metabolic disorders. Moreover mice mutants for clock genes display metabolic alterations. Our main line of research is to identify the molecular, cellular and physiologic mechanisms by which circadian clock controls metabolism. We recently showed that the transcriptional repressor KLF10 displays a strong rhythmic expression in mouse liver and is a direct target of molecular clock. In addition we reported that male mutant mice having a systemic deletion of Klf10 display hyperglycemia due to increased hepatic gluconeogenesis. This phenotype is explained by the direct regulation of the Pepck gene (rate limiting enzyme of gluconeogenesis) by KLF10. We also reported that Klf10 mutant female mice display hypertriglyceridemia and a shifted circadian expression of lipogenesis genes. Our data strongly suggest that KLF10 participates in the timing of hepatic metabolism, thus linking circadian clock and metabolism. To better understand the role of KLF10 in circadian regulation of liver metabolism, and its impact in physiopathology, we will pursue two main complementary objectives: (1) to determine the role of KLF10 in the rhythmic control of glucose and lipid metabolism in liver, which is a major organ for these process; 2) to determine the physiopathological consequences of the alteration of the KLF10 dependent clock-metabolism interaction. To address these questions, we will first identify at the genomic scale the direct targets of KLF10 in liver by ChIP -Seq. This approach will be completed by the analysis of the liver transcriptome from mice bearing an inducible -liver specific deletion of Klf10 that we will generate. In parallel, we will develop another mouse model with antiphasic expression of Klf10 in liver in order to determine the importance of the timing of Klf10 expression. The analysis of metabolic and circadian physiology of these two animal models coupled to the identification of the KLF10 directed gene network in liver will provide a mechanistic understanding of the KLF10 dependent regulation of metabolic pathways. Further, we will challenge these animals with either high-fat diet or temporal restricted feeding protocols to understand to which extent the alteration of circadian coordination mediated by KLF10 result in metabolic alterations or decreased synergy between circadian and food synchronisation. This project will provide the molecular and physiologic bases to understand a key interaction in physiology and will be useful to develop preventive or therapeutic approaches taking into account the temporal organization of metabolism.