Elimination programmée d'ADN chez un unicellulaire modèle : coordination entre coupure de l'ADN et réparation des cassures double-brin – CURE

Les cassures double brin (CDB) de l'ADN sont réparées soit par recombinaison homologue, soit par jonction directe des extrémités (NHEJ). Bien que potentiellement toxiques, des CDB programmées contribuent à des processus physiologiques essentiels (recombinaison méiotique, assemblage des gènes d'immunoglobulines). Nous proposons que de tels processus programmés nécessitent une étroite coordination entre coupure de l’ADN et réparation des CDB. Avec ses deux types de noyaux, le cilié Paramecium tetraurelia est un puissant modèle unicellulaire pour tester cette hypothèse. Le micronoyau diploïde (MIC) héberge le génome germinal transmis à la descendance sexuelle. Le macronoyau polyploïde (MAC), dérivant du MIC à chaque génération, contient le génome somatique réarrangé, substrat de la transcription. Pendant le développement du MAC, des réarrangements programmés éliminent ~30% d'ADN germinal, comprenant de l’ADN répété et 45 000 séquences internes (IES). L'excision des IES implique l’introduction massive de CDB à leurs bornes, puis une réparation précise par le NHEJ.

Le projet CURE comporte trois objectifs:

Objectif 1. Propriétés biochimiques et structurales de l’endonucléase.
Plusieurs composants de l'endonucléase sont déjà connus : une sous-unité catalytique, PiggyMac (Pgm), et cinq protéines apparentées (PgmL1 à 5) nécessaires in vivo pour couper les bornes des IES. Le complexe endonucléase actif comprend-il Pgm et toutes les PgmL ? Quelle est sa composition ? Grâce à des immunomarquages cellulaires et des approches biochimiques et biophysiques, nous déterminerons la stœchiométrie, l’ordre d’assemblage et l'organisation de sous-complexes reconstitués à partir de protéines recombinantes ou purifiés à partir de noyaux de paramécies. Nous mettrons en place des tests d’activité in vitro et entreprendrons l’analyse structurale de la machinerie endonucléase. Enfin, nous rechercherons de nouveaux facteurs associés à ce méga-complexe.

Objectif 2. Interaction de Pgm avec ses cibles chromatiniennes.
Les séquences éliminées ne présentent aucun motif conservé, suggérant que Pgm ne reconnaît pas ses sites de coupure via un motif spécifique. Son association stable avec le noyau nécessite des partenaires protéiques, comme les PgmL. Des ARN non codants participent aussi au ciblage des séquences à éliminer. Nous suivrons l'association de Pgm avec la chromatine par immuno-marquage et fractionnement nucléaire et comparerons ces données avec l’étude des sites de liaison de Pgm sur le génome, dans des cellules déplétées de différents facteurs (composants de l’endonucléase, chromatine et/ou ARN). Nous chercherons de nouveaux facteurs d'association à la chromatine en analysant le contenu en protéines et ARN de fractions chromatiniennes issues de noyaux purifiés.

Objectif 3. Analyses moléculaires et structurales du couplage entre coupure et réparation.
Un acteur spécialisé du NHEJ (Ku70/Ku80c), contenant un des trois homologues de Ku80 de P. tetraurelia, est requis pour stabiliser Pgm dans le noyau et induire les CDB, signe d’un couplage fort entre coupure et réparation. Pour caractériser la spécificité de Ku80c, nous comparerons les structures de Ku70/Ku80a et Ku70/Ku80c et rechercherons des interactants spécifiques de Ku70/Ku80c. Nous testerons l'effet de l'ajout de Ku aux complexes Pgm/PgmL dans les analyses structurales et fonctionnelles in vitro. Nous examinerons le rôle d'autres acteurs connus du NHEJ.

Les partenaires de CURE partageront leurs expertises complémentaires. Le partenaire 1 est reconnu en génomique, biologie moléculaire et cellulaire et biochimie de la paramécie. Le partenaire 2 est un spécialiste international de l'analyse biophysique et structurale des complexes de réparation de l'ADN. Le projet CURE permettra d’élucider les mécanismes impliqués dans l’interaction entre Pgm, PgmLs et les acteurs du NHEJ, la reconnaissance de leurs substrats, la coupure de l'ADN et sa coordination avec la réparation des CDB programmées.