Rôle du complexe co-activateur SAGA dans la transcription au cours de la différenciation cellulaire chez les mammifères – SAGA-Retina

Nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9 dans des cellules souches embryonnaires (ESC) de souris pour inactiver les gènes codant des sous-unités des complexes SAGA (Supt7l et Supt20) ou ATAC (Yeats2 et Zzz3). Bien que des ESC homozygotes nulles Suptl7-/- et Supt20h-/- aient été obtenues, nous n'avons pu isoler aucun clone mutant homozygote pour Yeats2 et Zzz3, ce qui suggère que ces gènes sont essentiels à la survie des ESC. Nous avons généré de nouvelles cellules mutantes exprimant les Yeats2 et Zzz3 endogènes fusionnées à la séquence Auxin-Inducible-Degron (AID) et nous avons pu induire une déplétion efficace de ces protéines lors du traitement par l'auxine. Des tests de croissance clonale de ces cellules ont été réalisés dans différents milieux pour mesurer la croissance cellulaire et l'auto-renouvellement des ESC.
Pour une mesure précise de la transcription de RNAPII, nous avons analysé la synthèse d'ARN naissants découplée de la dégradation de l'ARN en utilisant le marquage métabolique et la quantification des ARN nouvellement transcrits. Les différentes lignées de souris ESC ont été marquées avec de la 4 thiouridine (4-sU) pendant 10 min. L'ARN total a été extrait, mélangé à des ARN de drosophile marqués, fragmenté par sonication et les ARN marqués nouvellement synthétisés ont été biotinylés et purifiés. Le séquençage à haut débit de l'ARN a été effectué sur l'ARN total et marqué purifié (4sU-seq). Des bibliothèques pour le séquençage ont été générées en collaboration avec la plate-forme de séquençage à haut débit de l'IGBMC et le séquençage a été effectué sur un système Illumina Hiseq4000. Les analyses des données 4sU-seq ont mis en évidence une purification efficace des ARN nouvellement synthétisés, comme le révèle la présence de transcrits primaires avec une forte densité de lectures dans les introns et en aval du signal de polyadénylation.

1) La caractérisation des lignées mutantes pour SAGA et ATAC montre que ATAC, mais pas SAGA, est nécessaire pour la survie des cellules ES. ATAC et SAGA sont tous deux nécessaires à la croissance et à l'auto-renouvellement de ces cellules. La quantification des ARNm nouvellement synthétisés a révélé que SAGA et ATAC régulent préférentiellement différents groupes de gènes. La perte des sous-unités des modules HAT n'entraîne pas de défaut phénotypique ou transcriptionnel significatif. Ainsi, nos résultats indiquent que SAGA et ATAC sont nécessaires à la viabilité et à l'auto-renouvellement des cellules ES en régulant la transcription par différentes mécanismes, mais d'une manière indépendante de leur activité HAT.

2) Pour étudier le rôle du module SAGA DUB, nous avons analysé les phénotypes des embryons Atxn7l3-/- et Usp22-/-. Nous avons montré que Atxn7l3 et Usp22 sont tous deux nécessaires au développement normal mais que les embryons Atxn7l3-/- présentent un phénotype beaucoup plus sévère que les embryons Usp22-/-. Les expériences ChIP-seq ont révélé une augmentation spectaculaire des niveaux de H2Bub dans les embryons nuls Atxn7l3. Des analyses transcriptomiques ont mis en évidence des changements limités dans l'expression des gènes. L'ensemble de ces résultats indique que l'activité de désubiquitination de SAGA ne régule pas directement la transcription globale par l'ARN Pol II.

3) Pour étudier le rôle du SAGA dans les photorécepteurs, nous avons comparé le transcriptome et les marques épigénétiques dans la rétine de souris contrôle et SCA7. Nos résultats indiquent une diminution de l'expression des gènes spécifiques des photorécepteurs. Ces gènes sont fortement enrichis en H3K9ac, et présentent aux enhancers une acétylation H3K27 et un transcription des eRNAs. L'acétylation large de H3K9 pourrait jouer un rôle dans l'activation des enahncers, et leur dérégulation expliquerait la perte d'expression des gènes des photorécepteurs dans SCA7.

Les complexes SAGA et ATAC sont nécessaires à la maintenance des cellules ES de souris.
ATAC, mais pas SAGA, est nécessaire à la survie des cellules ES.
Les complexes SAGA et ATAC régulent principalement différents groupes de gènes dans les cellules ES.
Les fonctions SAGA et ATAC dans les cellules ES sont essentiellement non redondantes et indépendantes de leur activité HAT.

L'activité DUB de SAGA est nécessaire au développement embryonnaire normal.
La perte d'Atxn7l3 provoque un phénotype plus grave que la perte de la déubiquitinase Usp22.
La désubiquitination de H2Bub ne régule pas directement la transcription globale de Pol II.

Les gènes d'identité des photorécepteurs hautement exprimés sont régulés à la baisse dans la rétinopathie SCA7.
L'acétylation au sens large du H3K9 est liée aux activateurs d'identité de type cellulaire et à la transcription de l'ARNe.
L'altération des amplificateurs d'identité de type cellulaire explique la dysrégulation transcriptionnelle dans la rétine SCA7.

1. Helmlinger D., Papai G., DevysD., Tora L. What do the structures of GCN5-containing complexes teach us about their function? Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 2021 1864(2):194614.
2. Tourigny JP, Schumacher K, Devys D, Zentner GE. Architectural Mediator subunits are differentially essential for global transcription in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, Accepted manuscript
3. Wang F, El-Saafin F… Devys D, Vincent SD, Tora L. Histone H2Bub1 deubiquitylation is essential for mouse development, but does not regulate global RNA polymerase II transcription. Cell Death and Differentiation, Accepted manuscript.
4. Fischer V, … Tora L, Devys D. Two related coactivator complexes SAGA and ATAC control embryonic stem cell selfrenewal through two different acetyltransferase-independent mechanisms. Cell Reports, Under review (http://ssrn.com/abstract=3782006)
5. Niewiadomska-Cimicka A, … Hache A, … Trottier Y. SCA7 mouse cerebellar pathology reveals preferential downregulation of key Purkinje cell-identity genes and shared disease signature with SCA1 and SCA2. Journal of Neuroscience (accepted) (https://www.researchsquare.com/article/rs-27474/v2)

Le complexe SAGA est un coactivateur transcriptionnel ayant une activité d’acétylation des histones, une activité de désubiquitination et interagit avec la protéine TBP, liant la boite TATA. L’utilisation de nouvelles méthodologies nous a récemment permis de découvrir que, contrairement à ce qui était attendu, SAGA est indispensable pour la transcription de la très grande majorité des gènes par l’ARN polymérase II chez la levure. Bien que sa structure et sa composition soient très fortement conservées au cours de l’évolution, la fonction de ce complexe chez les mammifères est encore très mal connue. Ce projet vise à améliorer notre compréhension des fonctions du complexe SAGA pour la transcription par l’ARN polymérase II dans les cellules de mammifères. Nous chercherons plus particulièrement à déterminer comment les différentes activités de SAGA fonctionnent et influencent la différenciation des cellules souches embryonnaires (ES) en lignées cellulaires différenciées. Dans ce but nous mesurerons les taux de transcription en quantifiant les ARNm naissant dans des lignées de cellules ES que nous avons modifiées de façon à inactiver une ou plusieurs sous-unités de SAGA. Le développement embryonnaire chez la souris est un processus très hautement régulé, nécessitant en particulier la coordination précise de modifications de la chromatine et de l’expression des gènes. Pour mieux comprendre le rôle de SAGA au cours du développement embryonnaire chez la souris, nous nous concentrerons d’abord sur l’activité de désubiquitination (DUB) de SAGA. En utilisant des embryons de souris dans lesquels nous avons inactivé les gènes codant pour des sous-unités du module de DUB de SAGA, nous définirons les fonctions de ce module lors de la gastrulation et de l’organogénèse. Une expansion polyglutamine dans ATXN7, la sous-unité permettant d’ancrer le module DUB dans SAGA, est à l’origine d’une maladie neurodégénérative, appelée SCA7, affectant les photorécepteurs de la rétine. L’atteinte des photorécepteurs est corrélée avec une perte du programme d’expression des gènes spécifique de ces cellules. Nous déterminerons les mécanismes par lesquelles l’ATXN7 mutante peut entrainer ces altérations transcriptionnelles et le rôle de SAGA dans le profil particulier d’expression des gènes dans les photorécepteurs. L’ensemble de ces analyses devrait nous donner une meilleure connaissance des fonctions de SAGA dans les cellules de mammifères mais aussi lors de processus complexes comme la différenciation cellulaire ou lors de la gastrulation et de l’organogénèse. Ces meilleurs connaissances nous aiderons également d’étudier plus précisément comment une dérégulation de SAGA peut participer à la perte du profil d’expression des photorécepteurs dans SCA7.