Facteurs contrôlant l'instabilité génétique associée aux R-loops en cis et en trans – CisTransRloop

Pour réaliser ce projet, le consortium combine des expertises uniques et complémentaires en biologie moléculaire (détection des R-loops, ChIP-seq, mesures d’instabilité génétique), génomique (cribles systématiques chez la levure, séquençage de génomes) et microscopie (suivie de la localisation de gènes d’intérêt en imagerie sur cellules vivantes).

En interférant avec la formation de R-loops dans différentes situations mutantes, nous avons découvert que les loci formant ces structures sont repositionnés dans le noyau de manière dépendante des R-loops. Nous avons combiné des approches candidates et des cribles systématiques pour étudier les mécanismes moléculaires en jeu, révélant en outre que l'accumulation de R-loops, mais pas l’instabilité génétique causée par ces structures, agit comme signal de repositionnement. Les interactions moléculaires qui sous-tendent potentiellement ce processus sont en cours de caractérisation.
Afin de mieux comprendre comment les R-loops contribuent à la mutabilité du génome et d'identifier les élements génomiques agissant en cis dans ce processus, nous avons également initié la caractérisation des profils de mutations accumulés dans des mutants du métabolisme des R-loops.
Enfin, afin d'obtenir une vision exhaustive des processus cellulaires prévenant la formation des R-loops, nous avons utilisé des cribles génétiques dédiés pour identifier les gènes empêchant l'accumulation des R-loops et l'instabilité génétique associée. Ces approches ont permis de mettre en évidence de nouveaux facteurs empêchant la formation de R-loops ou modulant leur résolution, qui sont actuellement à l'étude.

A ce stade, le projet a généré de nouveaux outils et des données originales relatives à la compréhension du métabolisme des R-loops et de l’instabilité génétique associée à la transcription. Ce projet devrait ainsi améliorer notre compréhension de ces processus essentiels, notamment des multiples situations pathologiques auxquelles les R-loops ont été associées.

3 présentations à des congrès nationaux et internationaux.

De multiples facteurs mettent en péril l’équilibre entre la stabilité et l’expression du génome sur lequel repose l’homéostasie nucléaire. La formation de R-loops, générées par l’hybridation de l’ARNm naissant sur sa matrice d'ADN, est ainsi apparue comme une cause majeure d'instabilité génétique associée à la transcription. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les R-loops sont détectées et prises en charge dans le noyau restent mal compris. Plus particulièrement, les facteurs régulant en cis- et en trans- le devenir des R-loops dans l’espace et dans le temps sont pour la plupart encore méconnus. Sur la base de résultats préliminaires et d’approches uniques à notre consortium, ce projet se propose d’explorer les conséquences de la formation des R-loops sur la dynamique du génome, en utilisant la levure comme modèle d’étude.

1. Nous déterminerons comment les R-loops affectent l’organisation spatiale du génome.
Nous avons montré que l’apparition de R-loops sur des gènes modèles entraine leur repositionnement dans le noyau. Nous identifierons les mécanismes mis en jeu et évaluerons leur impact sur la génotoxicité des R-loops. Dans ce cadre, nous analyserons systématiquement la position des gènes et leurs niveaux de R-loops par des approches génomiques. Nous induirons ensuite la formation de R-loops sur des loci modèles et analyserons les conséquences en terme de localisation dans le noyau. Finalement, nous modulerons artificiellement la position d’un locus modèle dans le noyau et évaluerons l’impact sur la formation de R-loops et l'instabilité génétique.

2. Nous étudierons également comment les R-loops contribuent à la mutabilité du génome et à son évolution moléculaire.
Afin de comprendre pourquoi seules certaines R-loops sont génotoxiques, nous identifierons les mutations causées par l’accumulation de ces structures dans des mutants affectés pour ces processus. Les déterminants génomiques qui régulent la génotoxicité des R-loops seront ensuite identifiés par des analyses de corrélation, et confirmés à l’aide de systèmes rapporteurs.

3. Nous identifierons aussi les facteurs protéiques qui modulent en trans la formation des R-loops et affectent leur devenir.
Nous utiliserons des cribles génétiques innovants dans le but d’identifier systématiquement de tels facteurs, et caractériserons leur mode d’action à l’aide d’approches de biologie moléculaire et de biochimie. Leur conservation sera en outre étudiée dans le cadre d’une collaboration.

Pour réaliser ce projet, ce consortium combine des expertises uniques et complémentaires en biologie moléculaire, génomique et microscopie. Ce projet devrait ainsi améliorer notre compréhension de ces processus essentiels, notamment des multiples situations pathologiques auxquelles les R-loops ont été associées.