Conception d'un cycle de Calvin-Benson optimisé pour améliorer la fixation du CO2 et la photoproduction de biocarburants et de matières premières chimiques par les microalgues et les cyanobactéries – CalvinDesign

L'objectif du projet CalvinDesign est d’utiliser une approche de biologie synthétique et structurale (ingénierie génétique et métabolique) pour améliorer nos connaissances sur la structure, la fonction et la régulation du cycle de Calvin-Benson et améliorer son fonctionnement. Ce projet se concentre sur les modèles les mieux caractérisés de microorganismes photosynthétiques, la cyanobactérie Synechocystis PCC6803 et la microalgue verte eucaryote Chlamydomonas reinhardtii. L’originalité de ce projet est d'appliquer les principes et les méthodes de la biologie synthétique pour relever le défi que constitue l’amélioration de la fixation du carbone chez les microorganismes photosynthétiques. Les souches produites seront caractérisées dans des conditions variables, y compris des conditions de production de molécules d’intérêt industriel, pour générer de nouvelles connaissances. Les souches générées par le projet CalvinDesign constitueront des châssis microbiens uniques pour une production accrue de produits chimiques carbonés (alcools, alcanes, lipides, sucres, pigments, terpènes, etc.). Les connaissances obtenues offriront un grand potentiel pour coupler la protection environnementale, la transition énergétique et la croissance bioéconomique.

Les travaux sur Chlamydomonas (P1) et Synechocystis (P2) ont été initiés tel que prévu dans le projet.
Au début du projet, P1 a finalisé le kit MoClo (Modular Cloning). Afin de mieux comprendre le cycle de Calvin-Benson nous avons déterminé la structure atomique de toutes les enzymes du cycle de Calvin-Benson (11 enzymes) et de nombreux régulateurs chez Chlamydomonas. Toutes les structures ont été déposées dans la PDB. Certaines ont été publiées (PRK, RPI, FBA, TRXf2, TRXh1, TRXz) et les autres manuscrits sont en préparation.
Pour l’ingénierie métabolique, nous avons analysé les mutants KO de la PRK chez les deux organismes (P1+P2). Les mutants sont hétérotrophes et la phototrophie peut être restaurée par complémentation fonctionnelle en restaurant l’expression de la PRK par transformation du mutant par une copie sauvage du gène. Nous avons placé le gène de la PRK sous le contrôle de différents promoteurs afin d’obtenir des niveaux d’expression variables et ainsi déterminer la limitation imposée par la PRK sur le cycle de Calvin-Benson. Chez Chlamydomonas (P1), nos résultats indiquent que la PRK n’est pas limitante (limitation entre 50% et 80% du contenu WT) et une surexpression (jusqu’à 3x) n’a pas d’impact sur la fixation du carbone mesurée via la vitesse de la croissance cellulaire. Les résultats sont différents chez Synechocystis (P2). Des souches mutantes de cyanobactéries surproduisant de manière constitutive ou thermorégulée diverses versions de la Rubisco et de la PRK ont été construites. Ces souches ont été combinées à des circuits génétiques permettant l’expression de différentes terpène synthase (C10 ou C15). Le rendement en farnesene (C15) est augmenté d’un facteur 3,6 par surexpression d’une PRK de Cyanothece PCC 7425 alors que l’expression de l’opéron rbc de Synechococcus PCC7002 permet une augmentation plus limitée (+85%). Nous avons également analysé les régulateurs des enzymes du cycle de Calvin-Benson. Chez Chlamydomonas (P1), l’étude structurale des TRX nous a permis de comprendre que les charges de surface constituent un code moléculaire déterminant la spécificité des TRX pour leur cible. Naturellement les TRXf2 activent les enzymes du cycle de Calvin mais pas les TRX x, y ou h. Nous avons pu démontrer l’importance de ce code en modifiant la sélectivité d’une TRX par substitution des charges des résidus de surface et ainsi créer une TRXh1 capable d’activer les enzymes du cycle (manuscrit en préparation). Chez Synechocystis nous avons analysé le rôle de la protéine CP12 qui joue un rôle d’inhibition du cycle. L’absence de CP12 permet d’augmenter la production de limonène (C10) d’un facteur 3 et celle du bisabolène (C15) d’un facteur 2. Nous avons également montré que la photosynthèse est essentielle pour la croissance du KO CP12 en conditions mixotrophes. Nous avons également publié plusieurs articles de revue sur la biologie de synthèse des microalgues.

Nous avons pu apporter de nombreuses nouvelles connaissances sur la structure des enzymes du cycle de Calvin-Benson et de leurs régulateurs. Un résultat remarquable est la détermination de la structure de toutes les enzymes du cycle chez Chlamydomonas notamment la PRK qui résistait à l’analyse structurale depuis plus de 20 ans. Les données structurales vont permettre d’analyser l’organisation supramoléculaire du cycle et de développer des stratégies d’optimisation basées sur l’ingénierie supramoléculaire et l’ingénierie des régulations.
Nous avons obtenu des résultats intéressant concernant l’ingénierie métabolique du cycle de Calvin-Benson et notamment identifié des stratégies permettant d’augmenter de manière très significative la production de molécules carbonées chez Synechocystis. Ces stratégies constituent des pistes intéressantes pour l’optimisation de la production photosynthétique de molécules d’intérêt industriel, en particulier les terpènes. Nous nous sommes focalisés sur l’ingénierie de 3 enzymes du cycle alors que l’ambition était d’en analyser un plus grand nombre. Les résultats devront être complétés par des analyses sur les autres enzymes.
Le projet CalvinDesign a permis de générer de nombreuses données sur les enzymes du cycle de Calvin-Benson et leurs régulations. Ces données seront essentielles pour concevoir de nouvelles stratégies d’optimisation. Les travaux d’ingénierie métabolique ont permis d’identifier chez Synechocystis des stratégies permettant d’augmenter significativement la production de différents terpènes d’intérêt industriel.

1. Crozet P, Navarro FJ,..., Schroda M#, Smith AG#, Lemaire SD# (2018) Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology 7, 2074-2086. #Corresponding authors doi.org/10.1021/acssynbio.8b00251.
2. Lemaire SD, Tedesco D, Crozet P, Michelet L, Fermani S, Zaffagnini M, Henri J (2018) Crystal Structure of Chloroplastic Thioredoxin f2 from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Distinct Surface Properties. Antioxidants 7, E171. doi.org/10.3390/antiox7120171.
3. Marchand CH, Fermani S, Rossi J, Gurrieri L, Tedesco D, Henri J, Sparla F, Trost P, Lemaire SD, Zaffagnini M. (2019) Structural and biochemical insights into the reactivity of thioredoxin h1 from Chlamydomonas reinhardtii. Antioxidants 8, E10. doi.org/10.3390/antiox8010010.
4. Gurrieri L, ..., Crozet P, Marchand CH, Henri J, Trost P, Lemaire SD, Sparla F, Fermani S. (2019) Arabidopsis and Chlamydomonas phosphoribulokinase crystal structures complete the redox structural proteome of the Calvin-Benson cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 116(16): 8048-8053. doi.org/10.1073/pnas.1820639116.
5. Vavitsas K, Crozet P, Hamborg Vinde M, Davies F, Lemaire SD, Vickers CE (2019) The synthetic biology toolkit for photosynthetic microorganisms. Plant Physiol. 181: 14-27. doi.org/10.1104/pp.19.00345
6. de Carpentier F, Le Peillet J, Boisset ND, Crozet P, Lemaire SD, Danon (2020) Blasticidin S deaminase: a new efficient selectable marker for Chlamydomonas reinhardtii. Front. Plant Sci. 11: 242. doi.org/10.3389/fpls.2020.00242.
7. Le Moigne T, Crozet P, Lemaire SD, Henri J (2020) High-Resolution Crystal Structure of Chloroplastic Ribose-5-Phosphate Isomerase from Chlamydomonas reinhardtii-An Enzyme Involved in the Photosynthetic Calvin-Benson Cycle (2020) Int J Mol Sci. 21(20):7787. doi.org/10.3390/ijms21207787
8. Le Moigne T, Gurrieri L, Crozet P, Marchand CH, Zaffagnini M, Sparla F, Lemaire SD, Henri J. (2021) Crystal structure of chloroplastic thioredoxin z defines a type-specific target recognition. Plant J. 107: 434-447. doi.org/10.1111/tpj.15300
9. Le Moigne T, Sarti E, Nourisson A, Zaffagnini M, Carbone A, Lemaire SD, Henri J. (2022) Crystal structure of chloroplast fructose-1,6-bisphosphate aldolase from the green alga Chlamydomonas reinhardtii. J Struct Biol. 214(3):107873. doi.org/10.1016/jsb.2022.107873
10. Cassier-Chauvat c, Blanc-Garin V, Chauvat F (2021) Genetic, Genomics, and Responses to Stresses in Cyanobacteria: Biotechnological Implications. Genes (Basel) 12(4):500. doi.org/10.3390/genes12040500.
11. Veaudor T, Blanc-Garin V, Chenebault C, Diaz-Santos E, Sassi JF, Cassier-Chauvat C, Chauvat F. (2020) Recent Advances in the Photoautotrophic Metabolism of Cyanobacteria: Biotechnological Implications. Life (Basel).10(5):71. doi.org/10.3390/life10050071

L'épuisement irréversible des sources traditionnelles de combustibles fossiles associé à l'accumulation de gaz à effet de serre produits par leur combustion sont une incitation à développer des formes alternatives de sources éco-responsables de carbone réduit pour la production de carburants et de produits chimiques nécessaires à notre société. Les microorganismes phototrophes sont considérés comme prometteurs pour le développement de concepts innovants basés sur leur capacité inhérente à fixer le CO2, produisant ainsi diverses molécules organiques par un procédé durable dépendant de la lumière du soleil. Pour permettre à ces microorganismes de devenir des usines cellulaires efficaces pour la production biotechnologique commercialement viable et durable de produits chimiques, un défi majeur est d'améliorer leur métabolisme photoautotrophe d’assimilation du carbone. Jusqu'à présent, les stratégies d'ingénierie métabolique ont principalement porté sur la réorientation du carbone assimilé vers la production de produits chimiques spécifiques (par exemple des alcools ou des lipides), alors que la tâche difficile consistant à améliorer le processus photosynthétique en optimisant la fixation du carbone n'a pas encore été menée de manière aussi agressive. Tel est l'objectif du projet CalvinDesign.

Des pertes d'énergie importantes au cours de la photosynthèse peuvent être directement attribuées à des goulets d'étranglement cinétiques au sein du cycle de Calvin-Benson (CBC), fixateur de CO2. De nombreuses possibilités existent pour améliorer l'efficacité du CBC, au moins en changeant l'abondance des enzymes clés. L'objectif du projet CalvinDesign est de combiner la biologie des systèmes (protéomique, métabolomique) et la biologie synthétique (ingénierie génétique et métabolique, reconstitution de voies métaboliques, méthodologie Design/Built/Test) pour développer des souches de microalgues et cyanobactéries très efficace pour la fixation CO2. Ce projet se concentre sur les modèles les mieux caractérisés de microorganismes photosynthétiques, la cyanobactérie Synechocystis PCC6803 et la microalgue verte eucaryote Chlamydomonas reinhardtii.

L’originalité de ce projet est d'appliquer les principes et les méthodes de la biologie synthétique pour relever le défi que constitue l’amélioration de la fixation du carbone chez les microorganismes photosynthétiques. La conception des voies métaboliques (Design) visera à lever des goulets d'étranglement limitant le CBC qui ont soit déjà été suggérés (SBPase, Rubisco, enzymes TRX-dépendantes), ou seront identifiés au cours de CalvinDesign par des approches de biologie des systèmes (phase de test) ou par le biais de la reconstitution métabolique in vitro. En effet, nous allons assembler un CBC synthétique acellulaire permettant des tester rapides des combinaisons d'enzymes plus efficaces. Les principaux goulets d'étranglement seront débloqués par ingénierie métabolique en utilisant des outils moléculaires puissants. Les souches seront caractérisés dans des conditions variables, y compris des conditions industriellement pertinentes, pour générer de nouvelles connaissances pour un nouveau cycle d'analyse le long du Cycle classique «Design, Build, Test & Learn". L'objectif du projet CalvinDesign est d'initier le cycle en effectuant au moins deux itérations, générant de nouvelles connaissances sur le CBC, ainsi que de nouvelles souches. Ces souches seront testées pour valider leur gain global en termes d’efficacité photosynthétique et de fixation de CO2. Les souches générées par le projet CalvinDesign constitueront des châssis microbiens uniques pour une production accrue de produits chimiques carbonés (alcools, alcanes, lipides, sucres, pigments, terpènes, etc.). Ces souches synthétiques hautement efficaces seront d’un intérêt industriel et commercial et offriront offrira un grand potentiel pour coupler la protection environnementale, la transition énergétique et la croissance bioéconomique.