Blanc SVSE 8 - Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

Etudes structurales et fonctionnelles de la protéine mitoNEET aux niveaux moléculaires, cellulaire et sur l'animal – MIdiaZONE

Etudes structurales et fonctionnelles de mitoNEET aux niveaux moléculaire et cellulaire, et sur l’animal.

La découverte de mitoNEET ouvre de nouveaux horizons pour comprendre la maturation des protéines Fe-S extra-mitochondriales. Les travaux effectués dans le cadre de ce projet, aborderont des questions importantes sur le transfert des centres Fe-S de la mitochondrie vers le cytosol. L’identification des interactions entre mitoNEET et la pioglitazone devrait ouvrir de nouvelles perspectives pour améliorer l’efficacité des molécules pharmacologiques de dérivées du thiazole et du thiophène.

Elucider la fonction de mitoNEET dans la biogenèse et/ou la réparation des centres Fe-S cytosoliques chez les mammifères

Chez les mammifères, les protéines à centres Fe-S sont impliquées dans de nombreux processus vitaux de la cellule, tels que la synthèse et réparation de l’ADN et la biogenèse des ribosomes. La mitochondrie renferme une machinerie protéique d’assemblage des centres Fe-S, appelée ISC, essentielle pour la maturation des protéines Fe-S mitochondriales et extra-mitochondriales. Une mutation d’un des gènes impliqués dans la machinerie ISC est associée à des pathologies sévères telles que myopathies, ataxies et anémies. Cependant, le processus d’assemblage, de transport et d’insertion des protéines à centres Fe-S reste à ce jour peu connu chez les mammifères. <br />Récemment, mitoNEET a été identifiée comme étant la première protéine Fe-S de la membrane externe mitochondriale. Bien que la fonction de mitoNEET reste à ce jour inconnue, sa localisation subcellulaire et la coordination atypique de son centre Fe-S en fait un candidat potentiel pour véhiculer les centres Fe-S de la mitochondrie vers le cytosol. MitoNEET est également une cible de la pioglitazone utilisée dans le traitement du diabète de type 2. <br />Le projet est organisé en trois parties avec les objectifs suivants : i) la caractérisation fonctionnelle de mitoNEET dans la maturation des protéines Fe-S extra-mitochondriales, en particulier l’iron regulatory protein 1 (IRP1), en utilisant des approches in cellulo et in vivo, ii) l’étude du mécanisme de transfert du centre Fe-S de mitoNEET vers les protéines acceptrices et iii) comprendre le mécanisme d’action de la pioglitazone sur la fonction de transfert de mitoNEET. Ce projet est basé sur une approche multidisciplinaire alliant des approches biochimiques et biophysiques afin de définir le rôle de mitoNEET dans la réaction de transfert de Fe-S et comprendre le mécanisme d’action de la pioglitazone sur la fonction de mitoNEET, ainsi que des approches in cellulo et in vivo pour valider les résultats obtenus par les approches in vitro.

Le projet est basé sur une approche multidisciplinaire alliant :
- des méthodes biophysiques (spectroscopies RMN, Mössbauer, Raman, UV-visible) et biochimiques (Native PAGE, mesure d'activités enzymatiques, dosages colorimétriques, mutagenèse dirigée, expression protéique en système hétérologue et purification de protéines Fe-S en aérobiose ou anaérobiose) permettant d'étudier les changements conformationnels de mitoNEET ainsi que la perte de son centre Fe-S au cours de la réaction de transfert de centre Fe-S vers des protéines acceptrices. Ces méthodes permettent également d'étudier les interactions de ligands (pioglitazone, resveratrol-3-sulfate,…) avec mitoNEET et leurs effets sur la réaction de transfert et la stabilité du centre Fe-S de mitoNEET.
- des méthodes de biologie cellulaire et moléculaire (immunoblot, interférence ARN in cellulo et in vivo par l'utilisation de virus adéno-associés chez la souris, double hybride en système levure, co-immunoprécipitation) pour étudier la voie de maturation endogène de mitoNEET et identifier ses partenaires protéiques ainsi que l’impact d’une déficience en mitoNEET chez la souris sur la régulation du métabolisme du fer intracellulaire.

Les travaux de recherche effectués dans la période de 18 mois ont été focalisés sur la voie endogène de maturation et la fonction biologique de mitoNEET dans la biogenèse et réparation des centres Fe-S cytosoliques. L'approche combinée in cellulo (extinction de gène et phénotype) et in vitro (étude biochimique et biophysique utilisant les spectroscopies Raman, RMN, Mössbauer et UV-visible) nous permet de proposer que:
- la biodisponibilité en centres Fe-S de la cellule assure le bon repliement et la stabilité protéique de mitoNEET, montrant la pertinence physiologique du centre Fe-S de mitoNEET dans les cellules vivantes,
- le fer et le soufre mitochondrial, servant à l'assemblage les centres Fe-S dans la matrice mitochondriale, sont nécessaire à la maturation de mitoNEET,
- la formation du centre Fe-S de mitoNEET requiert une nouvelle voie mitochondriale dépendante de Hsc20/ABCb7/ALR et indépendante de la machinerie CIA.
- la sulfhydryl oxydase ALR n'est pas un composé de la machinerie mitochondriale ISC d'export comme cela a été proposé pour son homologue levure Erv1p,
- la protéine échafaud de la machinerie CIA, appelée NARFL, est sensible au stress oxdyant alors que mitoNEET y est résistante,
- mitoNEET est impliquée dans la réparation et non dans la biogenèse des centres Fe-S dans le cytosol,
- le premier accepteur physiologique de mitoNEET dans la réparation des centres Fe-S cytosoliques est l'aconitase/IRP1, un régulateur majeur de l'homéostasie du fer intracellulaire.

Les travaux accomplis et les résultats obtenus sont en grande partie en accord avec les questions scientifiques initialement posées. Nous avons identifié un rôle de mitoNEET dans la réparation des centres Fe-S cytosolique et non un rôle dans la biogenèse des centres Fe-S cytosoliques.
Sachant que le site de liaison du centre Fe-S de mitoNEET est orienté vers le cytosol, nous avons initié une recherche de partenaires protéiques de mitoNEET sur une forme soluble de mitoNEET(44-108). Cette partie du projet est en cours d'analyse.
L'étude de l'impact d'une déficience en mitoNEET sur le métabolisme du fer intracellulaire a été initié très récemment. Nous rechercherons une activation de l'IRP1 sous sa forme apo (trans-régulatrice) dans différent tissus (foie, coeur, muscle,...) chez la souris après extinction ou non de mitoNEET par l'utilisation des virus adéno-associés. Les tissus présentant une IRP1 active seront sélectionnés pour une étude approfondie de la régulation du fer intracellulaire sous le contrôle du système IRP. Les travaux programmés seront très utiles pour étudier les molécules redox (telles que resveratrol-3-sulfate, pioglitazone, glutathion,..) qui sont susceptibles de réguler la fonction de transfert de Fe-S ainsi que la stabilité de mitoNEET.

International
Revues à comité de lecture
1. Ferecatu I., Gonçalvez S, Golinelli-Cohen M-P., Clémancey M., Martelli A., Riquier S., Guittet E., Latour J-M., Puccio H ;, Drapier J-C., Lescop E. and C. Bouton, «The Diabetes Drug Target MitoNEET Governs a Novel Trafficking Pathway to Rebuild an fe-S Cluster into Cytosolic Aconitase/Iron Regulatory Protein 1«, J. Biol. Chem., 2014, 289 :28070-86.

Communications (conférence)
1. C. Bouton-Conférence invitée : Role of the mitochondrial protein mitoNEET in cytosolic Fe-S cluster repair (IUBMB Symposium-Fe-S2015-Iron Sulfur Cluster Biogenesis and Regulation-June 23-26 2015, Bergamo, Italy)

France
Communications (conférence)
1. M-P. Golinelli-Cohen-Conference invitée : Functional studies of mitoNEET, an Fe-S protein targeted by antioxidant molecules (10èmes journées de Biologie Cellulaire, 18-20 mai 2015, UPS-Orsay)
2. I. Ferecatu- Conference invitée : Dysfunction of the mitochondrial Fe-S cluster assembly machinery leads to the formation of the chemoresistant truncated VDAC1 isoform (10èmes journées de Biologie Cellulaire, 18-20 mai 2015, UPS-Orsay)

Actions de diffusion
1. C. Bouton- Séminaire: Rôle de la protéine mitoNEET, une nouvelle cible de l’antidiabétique pioglitazone, dans la régulation du fer intracellulaire (Hôpital Saint-Antoine, 8/12/2014)
2. C. Mons- Poster : Functional studies of mitoNEET, an Fe-S protein targeted by antioxidant molecules (10èmes journées de Biologie du Grand Campus, 18-20 mai 2015, UPS-Orsay)
3. M.-P. Golinelli- Poster : Functional studies of mitoNEET, an Fe-S protein targeted by antioxidant molecules (XIVième symposium ICSN, 18-19 juin 2015, Gif-sur-Yvette).

La mitochondrie est le site majeur de l’assemblage des centres fer-soufre (Fe-S) nécessaire à la maturation des protéines Fe-S mitochondriales, cytosoliques et nucléaires. Chez les mammifères, ces protéines sont impliquées dans de nombreuses fonctions biologiques, incluant la respiration oxydative, la synthèse et la réparation de l’ADN et la régulation de l’expression des gènes. Un défaut d’assemblage des centres Fe-S conduit à des pathologies sévères (myopathies, ataxies, anémies et encéphalopathie infantile). Récemment, une petite protéine mitochondriale, appelée mitoNEET dont la fonction reste à ce jour inconnue, a été identifiée comme étant la première protéine à centre Fe-S localisée à la membrane externe mitochondriale. Sa localisation et la liaison labile de son centre Fe-S particulier lié à trois cystéines et une histidine, en font le candidat idéal pour participer au transfert des centres Fe-S hors de la mitochondrie et ainsi maturer les protéines Fe-S extra-mitochondriales. Nos données préliminaires corroborent cette hypothèse en montrant une implication de mitoNEET dans la maturation de l’Iron Regulatory Protein-1 (IRP1), une protéine cytosolique à centre Fe-S qui contrôle l’homéostasie du fer intracellulaire. De plus, il a été identifiée comme une nouvelle cible de la pioglitazone, un antidiabétique de la famille des thiazolidinediones. Cette classe de molécules exerce un effet stimulant sur l’activité de l’insuline par des mécanismes encore mal connus. Des premières études suggèrent que la pioglitazone stabilise le centre Fe-S de mitoNEET, impliquant une action directe sur mitoNEET. Ce projet vise (i) - à préciser la fonction de mitoNEET dans l’assemblage des protéines Fe-S extra-mitochondriales et, en aval, sur le métabolisme du fer intracellulaire régulé par l’IRP1, par des approches de perte de fonction, allant de la cellule à l’animal, (ii) - à caractériser la fonction de mitoNEET dans un processus de transfert de Fe-S vers des accepteurs physiologiques, en particulier l’IRP1 et (iii) - à définir le mécanisme d’action de la pioglitazone sur la stabilisation du centre Fe-S de mitoNEET. Les deux dernières parties du projet se feront par des approches de biophysique, impliquant spectroscopies RMN, Raman et Mössbauer, et par des approches de biologie moléculaire et cellulaire pour valider l’approche in vitro dans un contexte physiologique.

Coordinateur du projet

Madame Cécile BOUTON (Institut de Chimie des Susbtances Naturelles)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IGBMC Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire
CEA/iRTSV/LCBM/pmb Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux
CNRS-ICSN Institut de Chimie des Susbtances Naturelles

Aide de l'ANR 350 000 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2013 - 36 Mois

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