Régulation des réponse Immunitaires par les interactions entre les chemokines et les protéoglycans: de l'approche structurale à l'approche in vivo – ChemImmun

Dans ce projet, nous avons utilisé la cytométrie en flux et l'histologie pour analyser la structure de la réaction du centre germinal chez des souris mutantes et pour identifier les cellules produisant la CXCL12 dans les organes lymphoïdes périphériques.
Des approches sérologiques (dosages d'immuno-absorbants liés aux enzymes - ELISA) ont été utilisées pour quantifier la réponse des anticorps sériques, ainsi que son affinité, vis-à-vis des antigènes modèles.
Des variants mutés de CXCL13 ont été produits et exprimés sous forme de protéines recombinantes. Ils ont ensuite été analysés par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et par résonance plasmonique de surface (SPR) pour déterminer leur capacité à se lier au sulfate d'héparane (HS). La capacité de ces variants mutants à se lier et à activer le récepteur CXCL13 spécifique (à savoir: CXCR5) à la surface des cellules répondantes a été déterminée par des tests de migration standard utilisant des cellules vivantes.

Nos résultats révèlent l'importance de l'immobilisation de CXCL12 dans la qualité de la réponse immunitaire humorale. Au cours de la réaction de GC, le CXCL12 immobilisé forme un gradient fixe avec une concentration plus élevée de la chimiokine dans la zone sombre. Les gradients opposés de CXCL12 et CXCL13 permettent aux cellules B de migrer entre la zone sombre et la zone claire en alternant l'expression de son récepteur CXCR4. Les cellules B sélectionnées dans la zone claire pour une affinité plus élevée avec l'antigène retournent dans la zone sombre où elles subissent d'autres cycles de prolifération et de mutation somatique, avant de retourner dans la zone claire pour des cycles de sélection supplémentaires. La perturbation de la liaison de CXCL12 à HS empêche l'établissement du gradient fixe nécessaire pour diriger les cellules sélectionnées vers la zone sombre, altérant ainsi le mécanisme de sélection des cellules portant une affinité croissante pour l'antigène. En conséquence, les réponses en anticorps sont sous-optimales, montrant une maturation d'affinité altérée.
Ce travail montre également que la liaison de CXCL13 aux composants de la matrice extra-cellulaire peut également être abrogée, sans altération mesurable de la liaison de CXCR5. Ainsi, le paradigme que nous avions établi pour CXCL12 (à savoir: les domaines distincts et non chevauchants responsables de la liaison au récepteur de la chimiokine et à la matrice extracellulaire) est également applicable à CXCL13.

Les réalisations de ce projet fournissent des informations essentielles sur l’importance et le rôle de l’immobilisation de CXCL12 dans la réponse immunitaire à la MEC et ouvrent la voie à une exploration plus complète de la part de l’immobilisation par rapport à la diffusion des chimiokines dans le trafic de cellules au sein des CG, specialement l’importance des zones de différentes concentrations et isoformes.
Les résultats offrent notamment la possibilité de réaliser des expériences de structure / fonctionnement avec CXCL13, similaires à celles effectuées pour CXCL12.

PUBLICATIONS:

Pegeot P., Sadir R., Eriksson I., Kjellen L., Simorre J.P., Gans P., and lortat-Jacob H. (2015). Profiling sulfation/epimerization pattern of full-length heparan sulfate by NMR following cell culture 13C-glucose metabolic labelling. Glycobiology 25, 151-156

Monneau Y., Arenzana-Seisdedos F. and Lortat-Jacob H. (2016). The sweet spot: how GAGs help chemokines guide migrating cells. Journal of leukocyte Biology 99, 935-953

Monneau Y.R., Luo L., Sankaranarayanan N.V., Nagarajan B., Vivès R.R., Baleux F., Desai U.R., Arenzana-Seisdedos F. and Lortat-Jacob H. (2017). Solution structure of CXCL13 and heparan sulphate binding show that GAG binding site and biological activity rely on distinct domains. Open Biology 7, 170133

Barinov, A., L. Luo, P. Gasse, V. Meas-Yedid, E. Donnadieu, F. Arenzana-Seisdedos, and P. Vieira. (2017). Essential role of immobilized chemokine CXCL12 in the regulation of the humoral immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 114:2319-2324.

Huang HY, Rivas-Caicedo A, Renevey F, Cannelle H, Peranzoni E, Scarpellino L, Hardie DL, Pommier A, Schaeuble K, Favre S, Vogt TK, Arenzana-Seisdedos F, Schneider P, Buckley CD, Donnadieu E*, Luther SA*. (2018) Identification of a new subset of lymph node stromal cells involved in regulating plasma cell homeostasis. Proc Natl Acad Sci U S A 2018 115(29):E6826-E6835. * contributed equally to this work

Nous avons développé un projet ambitieux visant à explorer l’importance fonctionnelle de l’immobilisation des chimiokines in vivo. Cette immobilisation repose sur des interactions entre les chimiokines et les héparanes sulfates (HS), des polysaccharides présents dans les matrices extracellulaires et à la surface des cellules. Ces interactions permettent de limiter la diffusion des chimiokines, impactant leur distribution spatial et facilitant ainsi la formation de gradients de concentration locaux qui synchroniserait la mobilité cellulaire (haptotaxis) et l’adhésion dépendante des intégrines. Dans ce cadre, nos travaux, soutenus par deux projets ANR (CHEMOGLYCAN,puis CHEMREPAIR) se sont focalisés sur la chimiokine essentielle, CXCL12 . Ils ont permis de caractériser structurellement et fonctionnellement le complexe CXCL12/HS, apportant ainsi les bases conceptuelles nécessaires à l’établissement du premier modèle animal permettant la mise en évidence, in vivo, du rôle clé de cette interaction chez la souris. Cet animal porte des mutations dans le gène Cxcl12 (Cxcl12Gagtm) qui suppriment les interactions de la protéine correspondante avec les HS, sans affecter les capacités agonistes sur le récepteur CXCR4, se développe normalement et exprime des taux normaux des trois isoformes CXCL12. Néanmoins, après une ischémie aigüe, cet animal montre une revascularisation défaillante, lié à une forte réduction du recrutement de cellules progénitrices vasculaires. L’administration exogène d’une forme sauvage de CXCL12, liant les HS avec une très forte affinité, normalise la revascularisation, alors que celle de la protéine mutée, reste sans effet. Ces travaux, publiés récemment, démontrent le rôle clé joué par l’interaction CXCL12/HS dans un processus physiopathologique, documentant ainsi le paradigme de l’immobilisation des chimiokines in vivo. Sur la base de ces résultats, notre nouveau projet vise à explorer la contribution des interactions CXCL12/HS dans la régulation de la réponse immune, et étendra ce concept à d’autres chimiokines constitutives, impliquées de manières importantes dans la migration et l’adressage des leucocytes. Nous avons en effet découvert que les souris Cxcl12Gagtm/Gagtm ont un niveau de gammaglobulines sériques réduits. De plus, l’analyse de sous populations de cellule B révèle une diminution de cellule B matures recirculantes et de plasmocytes dans la moelle osseuse. Ces observations originales suggèrent donc aussi un rôle important de l’interaction CXCL12/HS dans la régulation de l’homéostasie des cellules B. Les mécanismes sous-tendant cette anomalie seront donc analysés. Notre hypothèse de travail est que l’absence d’interaction entre CXCL12 et HS affecte le trafic et la rétention des cellules B activées dans des conditions homéostatiques ou après immunisation. De plus, nous pensons que les données acquises sur CXCL12 ont une portée générale et s’appliquent à d’autres chimiokines, CXCl13, CCL19 et CCL21 en particulier, qui sont spatialement et fonctionnellement liées à CXCL12 dans le contrôle de la migration et l’adressage tissulaires des leucocytes ainsi que dans l’organisation des organes lymphoïdes secondaires. Néanmoins, l’absence de données biochimiques et structurales concernant l’interaction de ces chimiokines aves les HS ne permet pas pour l’instant l’ingénierie de modèles pertinents pour une analyse du rôle de ces interactions in vivo. De ce fait, il n’est pas possible aujourd’hui d’avoir une vue complète concernant l’importance de l’immobilisation tissulaires des chimiokines dans l’organisation des organes lymphoïdes secondaires et dans l’orchestration de la réponse immune. Le but de ce projet est de compléter ce manque de connaissance. Pour cela, nous avons réuni un consortium, dont les expertises complémentaires en biochimie des chimiokines et glycobiologie, biologie des lymphocytes B et T et imagerie dynamique des cellules du système immunitaire, garantissent la faisabilité du projet.