Développement d'un vaccin glycoconjugué contre la mélioïdose – MELIVAC

De nouvelles méthodologies ont été mises au point en vue de préparer des mimes « fonctionnels » de l’unité répétitive des trois principaux polysaccharides de surface de Bp, i.e. le polysaccharide capsulaire, l’exopolysaccharide et le lipopolysaccharide. Les méthodes développées sont généralisables à la synthèse de glycosides bactériens comportant divers aglycones. Les sucres ont été testés pour leurs interactions avec des anticorps monoclonaux spécifiques aux polysaccharides de surface de Bp. Pour ce faire, une méthode immuno-enzymatique, la résonance des plasmons de surface et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire par différence de transfert de saturation ont été utilisées. Les sucres ont été fonctionnalisés à leur extrémité réductrice par un bras espaceur aminé permettant leur couplage avec l’anatoxine diphtérique, une protéine porteuse approuvée cliniquement. Les conjugués sucres-protéines ont été évalués pour leur immunogénicité chez la souris en présence d’un adjuvant. Les niveaux d’anticorps IgG ont été évalués dans le sérum sanguin des souris immunisées à l’aide d’une méthode immuno-enzymatique.

Des molécules mimes des trois principaux polysaccharides de surface de Bp et des bactéries pathogènes apparentées du genre Burkholderia ont été synthétisées. Les oligosaccharides et leur conjugués représentent des vaccins et outils de diagnostic potentiels contre la mélioïdose, la morve et le syndrome de Cepacia. Ce projet a mené à la mise en place de partenariats internationaux avec les groupes des Prof. Paul J. Brett, Mary N. Burtnick (University of South Alabama), David P. AuCoin (University of Nevada School of Medicine), Antonio Molinaro et Alba Silipo (University of Federico II).

Bp est une bactérie hautement virulente par voie respiratoire, multi-résistante aux antibiotiques, et présente un taux de mortalité très élevé (=50%). Aucun vaccin n’est disponible pour s’en protéger. En outre, le nombre de cas de mélioïdose à travers le monde ne cesse de croître. Ces facteurs font de Bp une arme biologique de choix pour les terroristes et une préoccupation majeure pour les acteurs de santé publique. La découverte d’un vaccin fonctionnel contre la mélioïdose est donc une priorité pour le gouvernement français. La Direction Générale de l’Armement (DGA) est également intéressée par un tel vaccin. En effet, certains pays, dont l’ancienne U.R.S.S. et l’Égypte, ont déjà étudié la possibilité de développer une arme biologique basée sur Bp. De plus, des cas de contamination avec Bp sont fréquemment rapportés par les soldats et le personnel militaire œuvrant en zone d’endémie.

Les résultats ont fait l’objet de trois articles dans J. Org. Chem. (2014, 79, 4615 ; 2015, 80, 10386 ; 2016, ASAP) et d’un article dans ACS Chem. Biol. (2015, 10, 2295). Un article d’envergure est en préparation afin de diffuser les résultats concernant les mimes du LPS. Plusieurs communications orales, affiches et conférences invitées ont été données en lien avec ces travaux, dont deux présentations orales à l’International Carbohydrate Symposium (2014 à Bangalore et 2016 à New Orleans).

Burkholderia pseudomallei (Bp), l’agent infectieux de la mélioïdose, est la cause d’importants problèmes de santé en Thaïlande et en Australie. En raison de sa haute infectivité par voie respiratoire, de sa résistance accrue aux antibiotiques et de son taux de mortalité élevé, Bp est considérée comme une arme biologique potentielle de bioterrorisme. Le développement d’un vaccin fonctionnel contre la mélioïdose, qui pourrait protéger aussi bien la population que les soldats, est d’une importance capitale pour les gouvernements occidentaux. La membrane externe de Bp est couverte par un dense réseau de polysaccharides (LPS, PSC et EPS) qui agissent comme facteurs de virulence de la bactérie, et peuvent activer la production d’anticorps protecteurs chez l’homme. L’objectif principal du projet de recherche est le développement d’un vaccin glycoonjugué contre la mélioïdose basé sur la liaison covalente entre des sucres synthétiques et une protéine porteuse immunogénique. À cette fin, nous proposons de mettre au point des voies de synthèse performantes pour la préparation d’oligosaccharides mimes de l’Ag-O du LPS, du PSC et de l’EPS de Bp, fonctionnalisés à leur extrémité réductrice par un espaceur aminopentyle. Les oligomères du PSC de Bp présentant une succession linéaire de résidus 2-O-Ac-6-déoxy-beta-D-manno-heptopyranoses seront synthétisés via une approche de glycosylation intramoléculaire. En route vers la synthèse de mimes de l’EPS de Bp, une nouvelle méthodologie sera développée pour la formation stéréosélective des liaisons beta-D-Kdo. L’ester de méthoxyphénacyle sera utilisé en tant que groupement auxiliaire en position C-1. Il devrait permettre la stabilisation de l’ion oxonium via la face alpha du cycle Kdo, favorisant ainsi le couplage sur la face beta moins encombrée. De surcroît, trois hexasaccharides présentant un motif d’acétylation/méthylation naturel non-stoechiométrique seront synthétisés selon une approche convergente basée sur la combinaison judicieuse de deux donneurs taloses et d’un accepteur glucose. Les oligosaccharides synthétisés seront testés pour leur antigénicité chez la souris. Les sucres générant le meilleur profile immunogénique seront liés d’une manière covalente avec la protéine CRM-197. La conjugaison sera effectuée en tirant avantage des 39 résidus lysines présents sur la protéine porteuse via un couplage de type ester NHS ou en présence de thiophosgène. Le ratio sucres sur protéine sera déterminé par analyses SDS-PAGE et MALDI-TOF-MS tandis que les spectroscopies RMN 1H et dichroïsme circulaire seront utilisées pour évaluer l’intégrité de la protéine après modification. Les souris BALB/c seront immunisées avec les glycoconjugués synthétiques, et seront ensuite infectées avec une souche virulente de Bp. Le potentiel immunogénique des vaccins glycoconjugués sera mesuré selon leur capacité à accroître la durée de vie des souris infectées et, éventuellement, de les protéger contre l’infection à Bp.