Modulation thermique et lecture fluorescence/Raman pour l'analyse cinétique de réseaux de réactions chimiques/biologiques – T-KiNet

Nous souhaitons mettre en place une puissante méthode de caractérisation de réseaux de réactions dont les réactifs et produits définissent les noeuds (jusqu'à trois noeuds seront considérés). Incluant la mesure des constantes cinétiques, cette approche repose sur l'analyse de la réponse d'un système réactif à des excitations thermiques. Elle permettra des mesures aisées de flux dans des réseaux de réactions, fournissant un ampèremètre chimique inédit. Elle permettra aussi de tester si un réseau réactif est à l'équilibre ou dans un état stationnaire hors-équilibre, situation courante dans les milieux biologiques. Bien que notre approche analytique soit non invasive et totalement compatible avec les contraintes du in vivo, ce projet se concentrera sur l'analyse in vitro. Nous utiliserons cependant des réactifs d'intérêt biologique et l'étape suivante devrait être l'analyse de réseaux dans des systèmes vivants.
Ce projet intègre de multiples développements. Au delà de leur importance pour la réalisation du projet, ces développements sont signifiants par eux-mêmes et devraient être mis en oeuvre à court terme par une importante communauté de scientifiques. Des aspects théoriques, instrumentaux et des systèmes réactifs seront étudiés au cours du projet:
• Les développements théoriques aborderont dans une perspective générale la caractérisation de réseaux de réactions d'intérêt biologique à l'aide d'une faible oscillation de température (1-5K), en analysant la réponse des concentrations des réactifs au premier et au second ordre de la perturbation. Des critères discriminant des classes de réseaux seront définis afin d'attribuer un mécanisme chimique à un réseau inconnu. On examinera par ailleurs le plan d'expériences à mettre en oeuvre pour caractériser qualitativement et quantitativement la dynamique d'un réseau réactif.
• Nous fabriquerons plusieurs dispositifs miniaturisés pour moduler la température dans une chambre d'observation, dans une gamme étendue de fréquences (0.1-104 Hz). Dans le premier design, une couche résistive sera parcourue par un courant électrique afin de chauffer la cellule d'observation en mode alternatif. Dans le second, nous injecterons directement dans le tampon un courant alternatif façonné, modulant ainsi sa température par effet Joule. Ces microchambres chauffantes pourront donner accès aux propriétés thermodynamiques et cinétiques de nombreux processus d'intérêt biologique, les rendant attractifs pour la mise en place de tests biologiques.
• Nous utiliserons l'émission de fluorescence et la spectroscopie Raman pour mesurer la concentration des réactifs. Les expériences seront menées en parallèle avec ces deux observables pour effectuer la validation croisée de nos protocoles analytiques. En particulier, pour pouvoir travailler à haute fréquence et à basse concentration, nous avons retenu la diffusion Raman cohérente anti-Stokes (CARS) et la diffusion Raman stimulée (SRS). Avec des schémas de détection synchrone et sensibles à la phase rendus possibles par la modulation de température, ces méthodologies Raman pourraient émerger comme des outils analytiques sélectifs et puissants.
• La validation de nos protocoles d'analyse de réseaux nécessite des systèmes réactifs inédits (i) obéissant à des mécanismes triangulaires dont les constantes cinétiques s'échelonnent sur plusieurs domaines de temps de relaxation; (ii) facilitant leur observation simultanée par émission de fluorescence et par spectroscopie Raman. Nous définirons ainsi des systèmes modèles reposant sur des associations entre acides nucléiques. Nous mettrons ensuite en oeuvre nos protocoles pour caractériser deux réseaux réactifs significatifs en pharmacologie des systèmes et en repliement des biomolécules. Au delà de la preuve de principe de notre approche analytique, nos résultats devraient apporter de nouvelles informations mécanistiques sur les processus étudiés.