Microscopie électrochimique à Nanocavité pour l’imagerie fonctionnelle de cascades enzymatiques. – CASCADE

Ce projet propose de développer : (i) un système biomimétique reproduisant les cascades enzymatiques naturelles, en mettant au point une stratégie expérimentale d?assemblage d?enzymes en 2D d?une façon spatialement contrôlé à l?échelle nanométrique. (ii) Une microscopie électrochimique et à force atomique (AFM/SECM) permettant de sonder localement le fonctionnement de ces enzymes, et leurs couplages cinétiques, et ce à une échelle allant de quelques centaines de molécules d?enzymes, à celle de la molécule d?enzyme unique. L?intérêt spécifique de ne s?adresser ainsi qu?à un très petit nombre de molécules d?enzymes est qu?il s?agit là de la seule démarche expérimentale permettant d?établir une corrélation entre l?activité d?une enzyme et la fluctuation (temporelle et d?une molécule à l?autre) de son comportement catalytique. Pour le présent projet, utiliser une technique à sonde locale aura l?avantage de nous permettre de sonder spécifiquement le comportement fonctionnel de groupes d?enzymes en fonction de leur position dans l?assemblage, c?est à dire en fonction de leur couplage diffusionel avec les populations d?enzyme voisines. Dans les systèmes naturels, l?organisation cellulaire d?enzymes coopératifs en « clusters » supramoléculaires est un élément clef du métabolisme. Un avantage majeur de cette organisation est le transfert d?intermédiaires biosynthétiques entre les sites catalytiques sans diffusion dans le milieu cellulaire. Ce phénomène, appelé « metabolic channeling » est supposé permettre une accélération des vitesses de réaction et un ajustement fin des voies metabolitiques. Le premier objectif de ce projet est de vérifier ce modèle expérimentalement en assemblant des complexes enzymatiques artificiels de manière contrôlé. En utilisant la nanolithographie, avec l?aide du LAAS, nous mettrons au point une nanoplateforme permettant un contrôle précis de deux enzymes couplés en une cascade rédox. Dans un premier temps nous espacerons les enzymes de plusieurs centaines de nanomètres, afin de mimer les systèmes enzymatiques naturels dont les réactions sont sous contrôle diffusionels. Dans un second temps, les deux enzymes seront espacés de 10-50 nm de façon à reproduire le phénomène de « channeling ». Des capsides de virus seront utilisées comme « gabarits » d?assemblage pour contrôler la distribution des enzymes. Puisque l?enzyme en bout de chaîne sera une enzyme rédox , la glucose oxydase, qui accepte une large palette de cofacteurs rédox, l?électrochimie est la technique de choix pour étudier le comportement cinétique de la chaîne enzymatique reconstituée. Aussi proposons nous de développer et d?utiliser pour cette étude, une technique qui nous permettra «d?isoler » de petits domaines enzymatiques sur la surface grâce à une microélectrode creuse. Cette nanoélectrode à cavité sera fabriquée à l?extrémité d?une sonde AFM. La sonde combinée AFM-SECM ainsi produite permettra de localiser les « clusters » d?enzyme sur la surface, mais autorisera aussi la mesure simultanée du courant électrochimique (faradique) associé au fonctionnement rédox de l?enzyme. En utilisant des microélectrodes à nanocavité, d?une taille de 100-500 nm il sera possible de choisir une population d?enzyme et d?en sonder le fonctionnement collectif. Là encore s?agissant d?une technique à sonde locale, la nouvelle microscopie électrochimique à nanocavité nous permettra de « sélectionner » la population d?enzyme à sonder en fonction de son positionnement spatial vis à vis d?autres populations, et donc pour un degré de couplage entres clusters d?enzyme variable. En utilisant des microélectrodes à nanocavité encore plus petites (10 nm) nous serons même en mesure de sonder molécule d?enzyme par molécule d?enzyme. Accéder ainsi au comportement catalytique d?une molécule individuelle présente en soit un grand intérêt puisque l?enzymologie « classique » ne rend compte que du comportement global d?un grand nombre de molécules d?enzymes. Peu d?approches expérimentales permettent d?accéder directement à la dynamique de l?enzyme à l?échelle de la molécule unique, aussi la plus part des données proviennent-elles principalement de simulations de dynamiques moléculaires. Explorer le comportement d?une seule, ou de quelques, biomolécules dans un environnement local complexe est d?un intérêt primordial pour la compréhension de l?efficacité des réactions catalysées par les enzymes et leurs fonctionnement. Une telle approche devrait se révéler très précieuse pour la compréhension fine et « in vivo » des mécanismes enzymatiques complexes.