Rôle des exosomes comme vecteurs infectieux dans les maladies à prions – EXOPRION

Les prions sont responsables de maladies neurodégénératives fatales touchant les mammifères dont l'homme. La nature exacte des entités infectieuses, l'identification de tous les compartiments infectieux et des mécanismes de dissémination intercellulaire restent à établir. Un certain nombre de cellules en culture sécrètent dans le milieu extracellulaire des microvésicules appelées exosomes qui, en cas d'infection, véhiculent l'agent. Dans ce projet, nous rechercherons l'infectiosité associée aux exosomes circulants dans les fluides biologiques de moutons atteints de Tremblante, un modèle proche du vCJD chez l'homme. Ces vésicules faciliteront la recherche d'éventuels co-facteurs associés à l'agent infectieux ainsi que la caractérisation des différentes formes de PrP anormale (PrPres, PrPsc PK-sensible) et de leur pouvoir infectieux. Nous utiliserons différents modèles cellulaires pour identifier les mécanismes responsables de l'adressage de la PrP et des prions dans les exosomes.Le modèle animal choisi est le mouton, hôte naturel de l'agent de la Tremblante, dont la taille et la physiopathologie de la maladie sont proches de celle de l'homme. Des agneaux seront infectés par voie orale par un isolat infectieux préalablement caractérisé. Les fluides biologiques riches en exosomes seront prélevés tout au long de la période d'incubation (6 mois) dans le cas du sang ou en phase terminale, pour les urines, la lymphe ou le liquide céphalo-rachidien. Pour déterminer leur charge infectieuse, les exosomes seront purifiés à partir des fractions acellulaires correspondantes et inoculés à des souris transgéniques très sensibles à cet isolat infectieux.
La purification d'exosomes produits par des cellules infectées ou non et leur analyse protéomique et transcriptomique permettront d'identifier les protéines et les acides nucléiques spécifiquement présents dans ces microvésicules infectieuses. Le fractionnement par gradient, et/ou par centrifugations différentielles seront utilisés pour purifier les différentes formes (PrPres, PrPsc PK sensible) de PrP anormale, procéder à leur caractérisation biochimique et à l'analyse de leur pouvoir infectieux.
Différents modèles cellulaires permissifs à la multiplication de plusieurs souches de prions seront mis à profit pour déterminer si la sécrétion dans le milieu extracellulaire d'exosomes infectieux est un processus dont l'efficacité varie en fonction de la souche. Certains de ces modèles seront utilisés pour identifier les composants de la machinerie cellulaire responsables du trafic intracellulaire conduisant à l'association de la PrP et des prions aux vésicules exosomales, notamment la machinerie ESCRT, les tétraspanines, les céramides et certaines protéines virales. La dynamique de la dissémination intercellulaire du prion pourra être étudiée dans des cultures où la sécrétion d'exosomes infectieux aura été perturbée expérimentalement.
Le modèle animal utilisé permettra de déterminer si les exosomes peuvent être porteurs de niveaux significatifs d'infectiosité et d'identifier les fluides biologiques infectieux. Leur présence dans le sang aurait des répercussions importantes sur les mesures à mettre en 'uvre pour assurer la sécurité sanitaire des produits sanguins.
Nous pensons que l'utilisation d'exosomes comme matériel infectieux facilitera la caractérisation, tant d'un point de vue biochimique que biologique, des différentes formes de PrP anormales. L'identification de macromolécules spécifiquement présentes dans les exosomes infectés pourrait déboucher sur des tests de diagnostiques non invasifs.
Les différents modèles cellulaires permissifs utilisés permettront l'analyse des mécanismes du trafic intracellulaire conduisant à l'association de la PrP et des prions avec les corps multivésiculaires et les exosomes. Ces travaux permettront de comprendre le rôle des exosomes dans la dissémination de ces agents.