Role de Dicer dans la pathogenèse aux infections par les Herpesviridae – DIC-HER-PATHO

Les organismes multicellulaires possèdent plusieurs mécanismes pour lutter efficacement contre les infections virales. Le « RNA silencing » dépend de la production de petits ARN (siARN pour small-interfering ou miARN pour microARN) par une RNAse III nommée Dicer. Certains sont capables d'interagir avec des gènes viraux, ce qui confère à la réponse innée un niveau de complexité supplémentaire.
Certains virus expriment des miARN capables de réguler les défenses de l'hôte ont appris à exploiter ce système de défense pour leur propre bénéfice. Notre objectif est (i) d'étudier l'implication éventuelle de dicer dans les mécanismes de susceptibilité/résistance des animaux aux herpes virus. (ii) de valider in vivo l'existence de miARNs prédits dans deux modèles, le Cytomegalovirus murin (MCMV) et le Mouse Herpes Virus 68 (MHV-68). (iii) d'évaluer in vivo le rôle de miARNs viraux dans la pathogénicité au cours d'infections aigues et au cours de réactions de réactivation de virus latents.
A. Rôle de dicer dans la susceptibilité/résistance aux Herpesviridae. Nous allons réaliser des infections ex vivo de cellules (fibroblastes embryonnaires, macrophages) isolées de souris contrôles ou dicer -/-. Les infections seront faites avec le MCMV ou le MHV-68 à doses élevées pour provoquer des réactions cytotoxiques. Nous mesurerons : l'expression des gènes précoces, intermédiaires et tardifs, la survie cellulaire et la réplication virale. Avec des doses faibles, nous établirons des lignées de fibroblastes embryonnaires infectées de façon latente pour, ensuite, provoquer la réactivation du génome viral. L'expression des gènes viraux et les réponses cellulaires seront mesurées. Puis, nous ferons des infections aigues in vivo. Pour quantifier les réponses de l'hôte, la survie des animaux et leur réponse humorale et cellulaire seront quantifiées. Le titre viral sera évalué dans différents organes. Avec des virus exprimant un gène luminescent, nous suivrons in vivo, la cinétique de l'infection grâce à la plateforme IVIS Lumina. Des expériences similaires seront réalisées à des doses sub-létales de virus pour établir des infections latentes. Après plusieurs semaines, nous induirons la réactivation virale et mesurerons la réponse chez des animaux contrôles et dicer -/-.
B. démontrer la validité de microARNs prédits chez le MCMV et le MHV-68. Nous réaliserons des infections de cellules (MEF, macrophages) isolées de souris contrôles et dicer -/-, suivies de la quantification des miR prédits. Leur validité sera établie d'après leur présence dicer-dépendante.
C. Evaluer le rôle des miR dans la pathogénèse des Herpes virus. Des infections ex vivo et in vivo seront faites avec des virus contrôles et mutés dans les gènes codant les miR validés (partieB). Les mesures seront similaires à celles décrites en A. Pour valider les effets des mutations dans les miR, les expériences de complémentations seront réalisées par des injections de miR de synthèse. Ce projet est destiné à décrire le rôle de dicer dans les réponses innées antivirales, plus particulièrement dirigées contre les herpes virus chez les mammifères. Nous pensons que cette étude permettra une description fonctionnelle complète des microARN viraux, autorisant ainsi dans le futur, la conception de virus modifiés, ce qui pourrait accélérer le développement de nouveaux vaccins.
Nous voulons aussi souligner le fait que cette stratégie pour étudier le rôle des miR dans la défense antivirale a suscité des collaborations avec des groupes intéressés par le rôle de la voie dicer dans la réponse antibactérienne (L. Navarro et P. Sansonetti), ce qui nous permettra d'élargir notre programme à l'analyse globale du rôle de dicer dans la réponse antimicrobienne.