– ApoMULTI-LIB

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : L'activation de voies de signalisation par de petites molécules synthétiques à visées thérapeutiques est un défi qui nécessite une approche pluridisciplinaire innovante. Les traitements anticancéreux actuels se fondent essentiellement sur les paradigmes liés à la croissance tumorale (chimiothérapie) mais ne ciblent généralement pas la cause tumorale (APL, ATRA, CML, imatinib). Récemment, ont vu le jour de nouvelles options thérapeutiques, basées sur la sélectivité antitumorale de TRAIL, un membre de la famille du TNF. TRAIL est un ligand membranaire de type II capable d'interagir avec les récepteurs agonistes DR4 et DR5 pour activer l'apoptose. Le partenaire 3 du projet a montré que les récepteurs antagonistes de TRAIL, encore appelés « leurres », inhibent de manière significative l'induction d'apoptose. Les preuves de concept de la sélectivité de TRAIL sont extrêmement solides et se basent i) sur des résultats cliniques de phase I et II ii) sur des résultats expérimentaux (souris déficientes pour TRAIL, xénogreffes) iii) sur des modèles cellulaires de tumorigénèse actuellement utilisés dans par le partenaire 1. L'exploitation thérapeutique du système TRAIL se base sur l'utilisation de TRAIL recombinant (Genentech) ou d'anticorps agonistes ciblant DR4 ou DR5 (Human Genome science). Nous proposons ici une nouvelle approche pour l'obtention de molécules thérapeutiques plus performantes ciblant le système TRAIL en exploitant un concept breveté par le partenaire 2 du projet. 2-Description du projet, méthodologie : Le partenaire 2 est un pionnier dans le développement de mimes fonctionnels de la famille du TNF basés sur la structure 3D du CD40 ligand. Nous utiliserons des méthodes variées et complémentaires pour obtenir des mimes ciblant les 4 récepteurs de TRAIL, afin de sélectionner des molécules aux propriétés agonistes ou antagonistes. Nous caractériserons et validerons les mimes ainsi obtenus par des approches in vitro et in vivo de manière à préciser leur potentiel anticancéreux en les combinant ou non à des molécules de chimiothérapie. Deux méthodes seront utilisées pour la synthèse des mimétiques : (i) Conception rationnelle, basée sur les données crystalographiques 3D de DR5, et peptidothèques issues de « Phage Display », (ii) Banque peptidiques multivalentes, permettant le criblage d'un grand nombre de structures mimétiques trivalentes portant des peptides tétramériques (puis pentamériques), synthétisées individuellement sur des billes en phase solide. La caractérisation, le criblage et la validation des molécules se feront de la façon suivante : (iii) Validation sélective, permettant de définir la spécificité des composés pour les récepteurs de TRAIL et leur potentiel apopotique (DISC, activation des caspases). La sélectivité tumorale des mimes sera évaluée sur des modèles cellulaires établis résumant les étapes de la transformation cellulaire, et sera comparée à TRAIL recombinant. (iv) Criblage haut débit de peptides trivalents. Après validation du criblage à l'aide de molécules mimétiques contrôles (CD40L et DR5), les mimes de la banque seront capturés par affinité (a) sur des colonnes contenant les récepteurs de TRAIL puis distribuées à l'aide d'un robot dans des plaques 96/384 puits (1bille=1composé / puit). L'apoptose sera alors évaluée sur les modèles cellulaires sensibles ou résistant à TRAIL. (b) à l'aide de récepteurs de TRAIL recombinants fusionnés à un fluorochrome. Dans ce cas, les billes, par séries de 1000, seront mélangées aux récepteurs recombinants et les billes fluorescentes séparées (µmanipulateur). Dans tous les cas, les mimes seront analysés par MS pour connaître leur séquence, puis resynthétisés pour validation in vitro et in vivo. 3-Résultats attendus : Nous identifierons de nouvelles molécules de synthèse mimant TRAIL douées de propriétés antitumorales spécifiques. Ce travail utilise pour la première fois une approche de synthèse originale pour obtenir des molécules ciblant la voie TRAIL. Les molécules de synthèse que nous génèreront seront plus efficaces que le TRAIL recombinant de Genentech ou les anticorps agonistes de HGS. En effet, elles seront plus stables, administrables par voie orale et leur production industrielle sera aisée. Enfin, outre les molécules agonistes et antagonistes produites, le projet permettra le développement de nouveaux outils permettant l'étude de la signalisation TRAIL utiles à l'ensemble de la communauté scientifique.