Métabolisme des actinobactéries: Exploration des connexions entre le complexe hybride PDH-ODH, la cascade de signalisation GlnH-GlnX-PknG-OdhI et l'exportateur de glutamate MscCG – GLUTACTINO

Les actinomycètes constituent un groupe de bactéries vaste et diversifié comprenant des agents pathogènes tels que Mycobacterium tuberculosis, des producteurs d'antibiotiques tels que les streptomycètes et des usines cellulaires industrielles telles que Corynebacterium glutamicum. Compte tenu de leur importance considérable dans de nombreux secteurs économiques et sociaux, une compréhension moléculaire détaillée de la physiologie des actinomycètes est importante, tant dans le contexte d'applications thérapeutiques qu'à des fins biotechnologiques. Le projet GLUTACTINO est basé sur les résultats de notre précédent projet ANR-DFG METACTINO et se concentre sur trois sujets passionnants étroitement liés à la plaque tournante du métabolisme central qui est le nœud du 2-oxoglutarate/glutamate. Dans nos travaux précédents, nous avons identifié un complexe hybride pyruvate/2-oxoglutarate déshydrogénase (PDH-ODH) chez C. glutamicum, avec des propriétés structurelles et de localisation inhabituelles. Des analyses au microscope à fluorescence ont montré que le complexe PDH-ODH forme des clusters aux pôles cellulaires et, dans les grandes cellules, un ou deux clusters supplémentaires au niveau du site de division. Dans le ‘work package’ 1, le nombre et la dynamique des molécules individuelles des quatre sous-unités OdhA, AceE, AceF et Lpd dans ces clusters seront déterminés quantitativement à l'aide de la microscopie à haute résolution, tout comme la dynamique de la formation des clusters. En outre, la cause moléculaire de la formation des clusters sera investiguée. Le second ‘work package’ comprend l'analyse de la voie de signalisation que nous avons identifiée, qui régule l'activité de l'ODH et donc le flux de carbone entre le cycle du citrate et l'assimilation de l'ammonium par la glutamate déshydrogénase. La voie comprend la protéine GlnH qui lie le glutamate/aspartate périplasmique, la protéine intégrale de membrane GlnX qui agit comme transducteur, la protéine kinase sérine/thréonine PknG et la protéine OdhI, qui est un inhibiteur d’ODH. Le domaine ‘associé à la tête de fourche’ (FHA) de OdhI se lie avec une grande affinité à la sous-unité OdhA du complexe PDH-ODH et inhibe ainsi l'activité de l'ODH. La phosphorylation de OdhI par PknG, qui a lieu lorsque PknG est activée par GlnH et GlnX en présence de glutamate ou d'aspartate dans le périplasme, empêche la liaison de OdhI à OdhA. Dans le ‘work package’ 2, cette cascade de signalisation sera quantifiée par des techniques de microscopie de localisation à molécule unique en ce qui concerne le nombre de copies de protéines et la stœchiométrie des composants, et la localisation subcellulaire, la colocalisation postulée et les coefficients de diffusion seront déterminés. En outre, nous rechercherons et explorerons d'autres partenaires d'interaction d'OdhI au-delà d'OdhA. Le ‘work package’ 3 se concentre sur l'exportateur de glutamate MscCG, car nos données préliminaires indiquent que la fonction de MscCG est liée à la cascade de signalisation GlnH-GlnX-PknG-OdhI. Le rôle de MscCG dans la transduction du signal et la nécessité des deux, OdhI et MscCG, pour la sécrétion de glutamate seront analysés. Les partenaires d'interaction possibles ainsi que les modifications post-traductionnelles de MscCG seront recherchés et la localisation cellulaire de MscCG ainsi que sa structure déterminées.